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本文聚焦细胞外靶向蛋白降解（eTPD）技术。阐述其相比传统抑制剂的优势，介绍 eTPD 的设计原理、降解剂模块及溶酶体靶向受体（LTR）的多样性，探讨面临的挑战与未来展望，为相关领域研究提供全面参考。
引言
靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation，TPD）是一种创新的治疗策略，它能通过设计的降解剂分子选择性去除有害蛋白。TPD 利用细胞内的自然降解途径，即蛋白酶体降解（主要用于清除细胞内蛋白）和溶酶体降解（也用于清除细胞外蛋白）。
2001 年，Craig Crews 和 Raymond Deshaies 团队开发出 PROteolysis TArgeting Chimeras（PROTACs），开启了 TPD 时代。PROTACs 是双功能嵌合体，可将靶蛋白与 E3 泛素连接酶相连，使靶蛋白泛素化后被蛋白酶体降解。目前，PROTAC 技术发展迅速，已有多种降解剂进入临床试验，主要用于肿瘤治疗，美国食品药品监督管理局（FDA）也批准了部分降解剂药物。
除了 PROTACs，还有一些利用自噬 - 溶酶体系统的细胞内 TPD（iTPD）降解剂，如 AuTophagosome - TEthering Compounds（ATTECs）、AUtophagy - TArgeting Chimeras（AUTACs）和 AUTOphagy - TArgeting Chimeras（AUTOTACs）。
然而，iTPD 主要适用于细胞内蛋白，而近一半的已知蛋白是细胞外或细胞膜相关的，这些蛋白中有许多是潜在的治疗靶点，但多数难以用传统方法靶向。因此，细胞外 TPD（eTPD）技术应运而生。eTPD 通过 “由外而内” 的策略，利用嵌合体分子使靶蛋白与介导内化和内吞作用的效应蛋白接近，最终将靶蛋白通过内吞途径运输到溶酶体降解。2020 年，首个关于 eTPD 的研究成功降解了多种病理相关蛋白，相关降解剂分子被称为 LYsosome TArgeting Chimeras（LYTACs）。eTPD 在血液肿瘤治疗等领域具有巨大潜力。
TPD 方法的优势
从药理学角度看，TPD 方法相比传统的基于占据驱动的蛋白抑制方法有诸多优势。以受体酪氨酸激酶（RTKs）为例，传统抑制剂只能抑制其激酶结构域，对下游信号传导的抑制作用有限，且无法阻断 RTKs 的支架功能和相关补偿信号。而 TPD 降解剂可消除整个 RTK 蛋白，持续抑制相关信号通路。
TPD 降解剂的另一个重要优势是用量低。由于降解剂分子可循环使用，诱导的降解具有催化性和亚化学计量性，在细胞内 TPD 中，所有相关分子最初都存在于细胞质中，降解剂循环相对明确；但在 eTPD 中，降解剂在细胞外结合靶蛋白后内化，其循环机制尚需进一步研究。
此外，一些以已知小分子抑制剂为弹头的 PROTACs，相比相应抑制剂副作用更少、毒性更低。这可能是因为 PROTAC 分子与靶蛋白的相互作用界面更大，提高了靶标亲和力，其诱导的三元复合物稳定性增加也可能有助于提高选择性。eTPD 中的 LYTACs 等分子基于已知小分子与蛋白靶标的相互作用，理论上也可能有类似效果。
eTPD 方法适用性广泛，已证明多种依赖溶酶体的 TPD 策略可用于膜蛋白、分泌蛋白和细胞外蛋白聚集体的降解。
eTPD 的一般原则
开发 LYTACs 和其他 eTPD 降解剂的基本概念是在细胞外空间诱导接近。降解剂分子的设计旨在一侧引入靶蛋白（POI）的识别界面，另一侧引入诱导降解途径所需的 “效应” 蛋白的识别界面，以形成由 POI、靶向嵌合体和效应蛋白组成的三元复合物。
在最先进的 iTPD 方法 PROTAC 技术中，效应蛋白是 E3 泛素连接酶；而在 eTPD 中，效应蛋白是质膜相关蛋白，可诱导 POI 内化并输送到溶酶体。因此，eTPD 降解剂分子包含两个不同的功能部分：与 POI 相互作用的部分（弹头，warhead）和与效应蛋白相互作用的部分（配体，ligand），两者通过连接子（linker）连接，形成经典的 “弹头 - 连接子 - 配体” 结构。目前，eTPD 领域尚无统一的命名法，本文采用与 PROTACs 类似的结构分类和命名方式。
降解剂模块的多样性
多种类型的分子可作为降解剂分子中的识别模块（弹头或配体），不同模块的理化特性差异会影响嵌合降解剂分子的药效学（PD）和药代动力学（PK）性质。
- 基于抗体的模块：在引入 LYTAC 技术和 eTPD 方法的首个里程碑式研究中，抗体被用作弹头特异性靶向多个 POI。目前，抗体是 eTPD 应用中最广泛使用的弹头类型，包括完整抗体、抗原结合片段（Fab）和纳米抗体等。抗体具有高度特异性，且生产技术成熟。然而，其生产成本较高、可能具有免疫原性，在血清中持续时间短，分子量大可能影响内化效率，不过在治疗血液肿瘤时，其在循环中的滞留特性可能有益。
- 肽：首个基于肽的 eTPD 弹头是一种多特异性整合素结合肽，用于降解多种整合素。全肽降解剂（弹头和 LTR 配体部分均为肽）具有完全基因编码的优势。肽基降解剂理论上比抗体更易内化，但存在免疫原性问题，且在治疗应用中的递送方法有待解决。
- 适配体：DNA 和 RNA 适配体已成功用于 eTPD 降解剂的识别模块。适配体可针对几乎任何蛋白靶标生成，具有特异性高、成本低、生产快速的优点，但存在体内稳定性差的问题，结构优化和化学修饰虽可解决部分问题，但会增加生产复杂性和成本，还可能引发生物相容性问题。
- 弹头特异性：小分子：小分子目前仅用于 eTPD 的弹头。小分子具有良好的 PD 和 PK 性质，生产成本低，但通常需要靶蛋白结构中有特定口袋才能结合，这限制了其在降解剂设计中的应用。
- 配体特异性：碳水化合物：LTR 配体的多样性与弹头相似，包括基于抗体、适配体和肽的配体等。在 eTPD 中，碳水化合物基配体较为常见，如第一代 LYTACs 中使用的甘露糖 - 6 - 磷酸（M6P）及其衍生物，以及第二代 eTPD 中基于 N - 乙酰半乳糖胺（GalNAc）的配体，GalNAc 是肝表达的去唾液酸糖蛋白受体 1（ASGPR）的天然高亲和力配体，常用于药物递送。
- 连接子：连接子在降解剂设计中常被忽视，但它影响弹头和配体之间的距离和取向，对 POI 的成功降解至关重要。优化连接子可提高靶向嵌合体的亲和力和降解效率，在 iTPD 中连接子还可用于引入额外功能，eTPD 领域有望出现类似发展，但连接子在 eTPD 降解剂中的重要性是否低于 iTPD 仍有待研究。
LTR 的多样性
LTR 和相关效应蛋白在 eTPD 中起关键作用，可根据其内化机制进行分类。
- 第一代（IGF2R/CI - M6PR）：胰岛素样生长因子 2 受体（IGF2R，也称为阳离子非依赖性甘露糖 6 - 磷酸受体，CI - M6PR）是首个用于 eTPD 的 LTR。其大的细胞外部分有多个结合位点，配体结合可诱导其构象变化，通过网格蛋白依赖的内吞作用内化，最终将货物输送到溶酶体降解，自身可回收至细胞膜或反式高尔基体网络。多种基于 IGF2R 的降解剂已被开发，使用不同的结合模块靶向 IGF2R。
- 第二代（ASGPR）：2021 年，多个研究小组独立报道将肝脏特异性 ASGPR 用作 eTPD 的合适 LTR。ASGPR 参与多种循环蛋白的降解，主要在肝细胞表达。其内化和内吞作用由寡聚化 / 聚集诱导，基于 GalNAc 及其衍生物的配体已被用于开发 ASGPR - 靶向降解剂。
- 其他常规 LTRs：除 IGF2R 和 ASGPR 外，还有多种替代 LTRs 被用于 eTPD，如整合素 αvβ3、低密度脂蛋白受体相关蛋白 1（LRP - 1）、葡萄糖转运蛋白（GLUTs）等，不同 LTRs 具有不同的组织表达模式，这对设计组织特异性降解剂至关重要。
- LTR 表达模式：eTPD 的降解效率取决于效应蛋白（LTRs 或特定 E3 泛素连接酶）在细胞表面的表达水平。目前已知的 LTRs 存在低表达和缺乏组织特异性的问题，寻找特异性表达的 LTRs 是 eTPD 领域的重要研究方向。不同 LTRs 在不同组织中的表达差异显著，如 IGF2R 分布广泛，而 ASGPR 主要在肝脏表达，了解这些差异有助于优化 eTPD 治疗策略，减少脱靶效应。
膜相关 E3 泛素连接酶作为 eTPD 中的效应蛋白
膜定位的 E3 泛素 - 蛋白连接酶可作为效应蛋白诱导 POI 货物的内化和降解。例如，Cotton 等人创建的双特异性抗体可招募膜结合的 E3 连接酶环指蛋白 43（RNF43）来降解程序性死亡配体 1（PD - L1）。RNF43 通常使特定蛋白泛素化用于内吞和蛋白酶体降解，但在该研究中，与 RNF43 的诱导相互作用导致货物通过溶酶体降解。
除 RNF43 外，锌和环指 3（ZNRF3）等相关 E3 连接酶也被用于货物内化和降解研究。使用双特异性抗体或双特异性 R - spondins（RSPOs）可诱导靶蛋白与 E3 连接酶接近，促进货物内化和降解。RNF43 和 ZNRF3 在人类结肠腺瘤和结直肠癌中的表达高于正常组织，可用于肿瘤治疗，但关于 ZNRF3 相关的泛素化形式及具体机制仍有待进一步研究。
使用膜嵌入的 E3 泛素连接酶作为效应蛋白是一种新型 eTPD 方式，与传统 LYTAC 方法不同，目前关于涉及 RNF43/ZNRF3 等 E3 连接酶的内吞机制仍缺乏信息。
不依赖 LTR 的直接内体 / 溶酶体靶向
一些研究报道了不依赖特定 LTRs 或膜结合 E3 泛素连接酶的 eTPD 方法。
- GlueTAC 技术：基于细胞穿透肽（CPP）和溶酶体分选序列（LSS）的组合构建体，使用工程化纳米抗体作为弹头，可与靶蛋白共价结合，克服低结合亲和力问题，但生产过程复杂，且纳米抗体可能与靶蛋白一起在溶酶体中降解，使用时需匹配降解剂与靶蛋白的浓度，同时还需关注含 PrUAA 的降解剂分子的安全性和稳定性。
- SignalTAC：利用不同的 LSS 序列促进网格蛋白介导的内吞作用和 POI 货物的溶酶体降解。该技术可使用抗体 / 纳米抗体或肽作为弹头，肽基 SignalTACs 因分子量小、尺寸小，可能比抗体基的更易内化，且该技术可完全基因编码，应用前景广阔。研究还进一步开发了基于改进内化信号的 SignalTACs，其内化机制与第一代不同，依赖小窝蛋白而非网格蛋白。
- 伴侣介导的自噬（CMA）：是一种不涉及囊泡形成的溶酶体蛋白水解途径。研究将含有 CMA 靶向基序的肽与单克隆抗体融合，构建的 Ab - CMA 嵌合体可降低体外和体内 EGFR、HER2 和 PD - L1 的水平，但该过程的具体机制，特别是嵌合体 - 货物复合物的内外转运效率，仍需进一步研究。
- 修饰纳米颗粒（MONOTAB）：通过用针对 POI 的抗体功能化纳米颗粒，实现高效内吞和溶酶体靶向，克服了传统 LYTAC 方法的一些问题，如特异性受体依赖性和钩状效应，还可促进溶酶体生物发生，且能降解非蛋白靶标，如细胞外囊泡（EVs）。
eTPD 的现状：挑战、展望和临床应用
- 挑战：eTPD 领域面临的挑战部分与 TPD 共性，部分具有特异性。由于研究相对较新，缺乏实验数据，许多机制尚不清楚，如不同靶点、配体和弹头之间降解效率差异的原因，以及内化效应蛋白（LTR 或特定 E3 泛素连接酶）是通过通用机制回收还是与 POI 一起降解等问题。此外，劫持特定 LTR 效应蛋白可能干扰其生理功能，如靶向胰高血糖素样肽 1 受体（GLP - 1R）可能影响葡萄糖稳态，且一些经典 LTRs 易被内源性配体占据，降低了其作为效应蛋白的功效。与 iTPD 一样，eTPD 也面临潜在的脱靶或靶上脱组织效应，降解剂分子的大小和疏水性导致其 PD/PK 性质不佳，口服生物利用度低，还存在钩状效应，需要深入研究降解剂的 PD/PK 以选择最佳浓度。
- 展望：eTPD 技术有三个主要发展趋势。一是扩展机制研究，更好地表征各种降解剂和其他参与 POI 内化和降解的组件的作用模式；二是优化降解剂，改善其性质以开发潜在疗法；三是扩展 eTPD 工具包，寻找新的靶蛋白和效应蛋白，创建新型降解剂。目前，研究人员正在探索新的靶蛋白，尤其是与病理过程更相关、在正常生理中作用较小的蛋白，以减少副作用。同时，通过开发更好的 LTR 配体、重新利用已知亲和力的分子作为弹头、构建完全基因编码的靶向分子和采用模块化解决方案等方式，设计新型降解剂。此外，先进的递送方法也在不断发展，如基于纳米颗粒的递送、DNA 折纸技术和工程化降解剂血小板等，这些方法有助于提高降解剂在病理部位的应用效果，避免脱靶效应，并为联合治疗提供可能。
- 临床应用：eTPD 降解剂的临床应用取决于靶蛋白在特定疾病发病机制中的重要性。癌症是 eTPD 药物开发最有前景的领域，许多致癌蛋白，如 EGFR、HER2 和 PD - L1 等，是常见的治疗靶点，eTPD 降解剂旨在破坏驱动肿瘤生长和扩散的信号级联。近年来，也有研究针对肿瘤免疫反应，如降解 CD24 以增强癌细胞对巨噬细胞的敏感性。在肿瘤学之外，eTPD 也开始应用于其他疾病，如通过降解前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶 /kexin 9 型（PCSK9）降低血浆低密度脂蛋白（LDL）水平，治疗动脉粥样硬化；降解与 2 型糖尿病相关的错误折叠的细胞外人类胰岛淀粉样多肽（hIAPP）；开发针对微生物病原体相关蛋白和病毒蛋白的降解剂，用于治疗感染性疾病；以及通过降解促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF），治疗慢性炎症和自身免疫性疾病。
结论
尽管 eTPD 领域相对年轻（首篇重要文章于 2020 年发表），但已取得显著进展。其在肿瘤学及其他领域具有巨大的治疗潜力，预计未来将继续快速发展，不断探索新的靶蛋白，开发新型降解剂架构，进一步明确分子机制，有望彻底改变癌症和其他严重疾病的治疗方式。本文总结了 eTPD 领域的近期进展和降解剂分子的构建原则，为该领域的进一步发展提供参考。
