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在神经科学研究中，确定神经元回路上下游细胞至关重要。为解决现有顺行追踪工具的不足，研究人员开展了基于理性设计蛋白 ATLAS 的研究。结果显示，ATLAS 能从基因确定的细胞进行严格顺行、单突触、非毒性的追踪且具活性依赖性。这为神经回路研究提供了新方法。
在神秘的大脑世界里，神经回路如同一张错综复杂的 “超级网络”，掌控着睡眠、感知、行为等各种生理活动。要想深入了解大脑如何运作，精准识别神经回路中细胞的上下游关系至关重要。然而，现有的追踪方法却困难重重。经典的蛋白质追踪方法，如使用小麦胚芽凝集素和辣根过氧化物酶，由于会被大多数神经元摄取，无法精确界定神经元回路。虽然基因工程改造的狂犬病病毒能从特定细胞逆行追踪神经回路，但一直缺少从基因确定细胞进行顺行追踪的有效工具 。尽管近期有腺相关病毒（AAV1）和基因改造的黄热病病毒（YFV）用于非特异性细胞的顺行追踪，但它们都无法实现从基因确定细胞的追踪。在这样的困境下，美国南加州大学等机构的研究人员决心突破，开展了一项极具创新性的研究。他们成功开发出一种基于理性设计蛋白的方法，即 ATLAS（anterograde transsynaptic label based on antibody - like sensors，基于抗体样传感器的顺行跨突触标记），相关研究成果发表在《Nature Methods》上。这一成果为神经科学领域带来了新的曙光，让科学家们对神经回路的探索迈出了重要一步。
研究人员开展此项研究主要运用了以下关键技术方法：一是 mRNA 展示技术，用于筛选能与 GluA1 结合的蛋白；二是构建多种质粒和病毒载体，如 AAV8 - ATLAS、AAV8 - DIO - mCherry 等，通过病毒注射实现基因传递和标记；三是电生理学技术，检测突触传递和验证追踪特异性；四是组织学和免疫细胞化学技术，观察和分析细胞标记情况。实验样本主要来源于 Sprague Dawley 大鼠和不同品系的小鼠，包括野生型小鼠、VIPR2 - Cre 小鼠、SST - IRES - Cre 小鼠等。
研究结果：
- 生成与 GluA1 结合的 AF：利用 mRNA 展示技术筛选出与 GluA1 N 端结合的纤维连接蛋白克隆 Fn9.3，命名为 AMPA.FingR（AF）。AF 能特异性结合神经元裂解物中的 GluA1，且其标记部分与 PSD - 95.FingR - tagRFP 重叠，还与内源性网格蛋白共定位，表明其位于突触周围和内吞区域。此外，AF 可被细胞内吞，且不影响突触传递。
- 体外和体内跨突触追踪：将 AF 与 Cre 重组酶融合构建 ATLAS，在体外实验中，转染 ATLAS 的细胞能实现跨神经元转运 Cre 并重组报告基因，证明其可介导跨突触追踪并为突触后细胞提供基因访问途径。在体内实验中，向小鼠内侧前额叶皮质（mPFC）注射 AAV8 - ATLAS，向纹状体（Str）注射 AAV8 - DIO - mCherry，结果在 Str 中检测到大量 mCherry 染色，表明 ATLAS 能介导跨突触转运 Cre，使突触后细胞表达 mCherry。
- 从基因确定的细胞追踪：构建 AAV8 - DIO - ATLAS，其表达依赖于 Cre。在野生型小鼠和转基因 Cre 小鼠中进行实验，如追踪初级视觉皮层（V1）到上丘（SC）、背外侧膝状体核（dLGN）到 V1 的投射，均观察到预期的标记结果，证明 ATLAS 能从基因确定的细胞进行顺行追踪。
- 提高跨突触标记效率：通过共表达外源性 BACE 与 ATLAS，发现当 AAV8 - BACE - HA 和 AAV8 - ATLAS 以 5:1 的比例注射时，能显著增加 Str 中被 mCherry 标记的细胞数量，使标记效率与 YFV 相当。
- 标记的跨突触特性：在 SST - Cre 小鼠中，将 AAV8 - DIO - ATLASFLP和 AAV8 - fDIO - mCherry 注射到 V1，结果显示几乎所有 mCherry 标记的神经元都与 At 共标记，表明 ATLAS 仅通过跨突触转移蛋白标记突触后神经元。
- ATLAS 不阻断突触传递：在 mPFC 和 Str 分别注射相关病毒后，对 Str 中的细胞进行全细胞贴片钳记录。结果显示，mCherry 表达细胞与未标记细胞相比，ChR2 诱发的兴奋性突触后电流（eEPSC）幅度、起始潜伏期和时间常数均无显著差异，证明 ATLAS 不阻断突触传递且无明显毒性。
- 电生理学证实 ATLAS 追踪的特异性：在 V1 - Str 回路中测量光遗传诱发电流，发现 ATLAS 标记的细胞比未标记细胞的 oEPSC 幅度和总电荷显著更大，表明 ATLAS 和 Cre 依赖的报告基因同时表达时，标记细胞更可能接受来自表达 ATLAS 的突触输入，且突触连接越强越易被标记。
- ATLAS 的单向和单突触特性：通过向 Str 注射 AAV8 - DIO - ATLAS 和 Lenti - hsyn - Cre，向 mPFC 注射 AAV8 - fDIO - mCherry，结果显示 mPFC 中无高于背景的标记，证明 ATLAS 不介导逆行标记。在追踪 V1 到 SC 再到副视束核（PBG）的多突触通路时，发现 ATLAS 仅在 SC 有大量标记，PBG 无显著标记，而直接向 SC 注射 ATLASCre时，PBG 有大量标记，表明 ATLAS 是单向且单突触的。
- ATLAS 的活性依赖性：向 mPFC 注射 AAV8 - ATLASsnCre和 AAV8 - hHM3Dq - mCherry，向 Str 注射 AAV8 - DIO - GFP，给部分小鼠注射氯氮平 - N - 氧化物（CNO）激活神经元。结果显示，CNO 处理的小鼠 Str 中 GFP 标记的细胞数量和总荧光强度显著高于未处理小鼠，表明 ATLAS 介导的跨突触标记具有活性依赖性。
- 替代突触小泡靶向结构域：将 ATLAS 中 VAMP2 的胞质结构域替换为抗突触结合蛋白 1 的纳米抗体（SYTnb），构建 ATLASsn。实验表明，ATLASsn在体内外均能有效介导跨突触标记，且无明显毒性，可用于追踪多种神经通路，如听觉皮层到下丘、mPFC 到屏状核、内嗅皮层到海马等。此外，研究还发现 ATLAS 跨突触标记在注射后 4 - 7 天显著增加，之后细胞数量增加较慢，但总强度相对线性增加，而突触前细胞标记在第一周后保持稳定。同时，ATLAS 在大鼠中也能有效介导跨突触标记。
研究结论与讨论：ATLAS 是一种通过精确定义机制，从基因确定的神经元介导跨突触追踪的理性设计蛋白。与其他病毒或非病毒追踪方法相比，其作用机制更为明确，且具有严格的顺行性、单突触性和活性依赖性。虽然 ATLAS 追踪需要在突触后细胞中表达重组酶依赖的报告基因，且在某些情况下需要预先确定突触后区域并注射报告基因，但这些问题可通过外源性表达突触前标记等方法解决。ATLAS 为神经科学研究提供了一种强大的工具，有助于深入了解神经回路的结构和功能。未来，通过对 ATLAS 的进一步优化和改造，有望用于追踪更多类型的神经元回路，标记对特定刺激有反应的回路，甚至用于研究记忆形成、突触修剪等过程中的回路变化 ，为神经科学领域的发展带来更多可能。
