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为解决细胞培养基成本高且依赖血清白蛋白（限制培养肉市场化）的问题，研究人员开展优化无血清 B8/B9 培养基的研究。他们发现多种食品级低价稳定剂可替代血清白蛋白，能降低培养基成本，推动培养肉产业发展。
在当今食品和生物医学领域，传统肉类生产面临诸多挑战。随着全球人口增长，肉类需求预计到 2050 年将大幅增加，然而传统肉类生产，尤其是牛肉生产，对土地和资源的消耗极大，且排放密集。目前约 90% 的农业用地用于动物养殖，按照现有的生产模式，难以满足未来的肉类需求。与此同时，培养肉作为一种具有潜力的新型肉类来源，逐渐进入人们的视野。它有望大幅减少土地使用和全球变暖效应，为可持续发展提供解决方案。
但培养肉走向市场的道路并不平坦，其中一个关键障碍就是细胞培养基的高昂成本。在细胞培养过程中，培养基的成本占据了生产总成本的很大比例，超过 95%。而且，目前的培养基高度依赖血清白蛋白，其高昂的价格以及生产规模的限制，使得血清白蛋白的供应成为培养肉产业发展的主要瓶颈。据估计，仅替换全球消费肉类 1% 所需的重组白蛋白产量就高达数百万公斤，远超许多工业酶的当前产量。
为了突破这些困境，来自奥地利工业生物技术中心（1acib）等多个研究机构的研究人员开展了深入研究。他们以牛肌肉干细胞为切入点，对无血清 B8/B9 培养基进行优化。研究人员致力于寻找食品级、低成本的培养基稳定剂，期望能够替代昂贵的血清白蛋白，从而降低培养基成本，推动培养肉产业的发展。最终，他们取得了一系列令人瞩目的成果，并将研究发表在《Scientific Reports》上。
研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。首先，他们从不同动物获取卫星细胞样本，如从 19 个月大的阉割西门塔尔牛获取牛卫星细胞（BSCs） ，从 6 个月大的雄性家猪获取猪卫星细胞（PSCs）等。接着，利用 Presto Blue 测定法和 Hoechst 测定法，分别检测细胞的代谢活性和 DNA 含量，以此评估细胞的增殖情况。同时，运用粘度测量技术，分析添加稳定剂对培养基粘度的影响，探究其对细胞增殖的潜在作用机制。此外，通过设计实验（DoE） ，研究不同稳定剂组合及其浓度对细胞增殖的影响，筛选出最优组合。
单添加生长因子（GFs）需更高浓度
GFs 是一类在细胞生长和分化过程中起关键作用的蛋白质，但它们在溶液中稳定性较差，部分 GFs 在 37°C 下的半衰期不足 1 小时。为了模拟肌肉肥大过程中 “重复物理活动” 的场景，研究人员对比了标准单处理方案和双处理方案对原代牛卫星细胞（BSCs）增殖的影响。以含有 0.8mg/ml 人血清白蛋白（HSA）的 B9 培养基为基础，研究发现单添加重组人肝细胞生长因子（rhHGF）时，需要 20ng/mL 的高浓度才能使 Presto Blue 信号提高 1.5 倍；而采用双添加方案时，仅需 2.5ng/mL 的 rhHGF 就能达到相同效果。这表明根据 GFs 的不稳定性调整添加方案至关重要，后续实验中研究人员均采用双添加 GFs 的方式。
食品级辅料对培养基成分的稳定作用
研究人员探究了甲基纤维素（MC）和外消旋丙氨酸（ALA）这两种食品级成分替代重组 HSA 对培养基的稳定效果。在短期增殖实验中，以添加不同成分的 B8 和 B9 培养基培养 BSCs，结果显示，MC 和 ALA 单独使用时，相较于 B8 培养基都能产生显著的积极效果；二者联合使用时，在较低浓度下（MC 为 0.1125g/L，ALA 为 10mM 甚至低至 5mM），能使 B8 培养基的稳定性与 HSA 相当。在 B9 培养基中，添加 MC 或 MC + ALA 在较低浓度下也展现出卓越的稳定效果。综合来看，MC（0.1125g/L）或 MC + ALA（0.1125g/L + 5mM）能使 B8 培养基达到与 0.8g/L HSA 相当的稳定水平；而 HSA（0.8g/L）、MC（0.45 - 0.1125g/L）和 ALA（20 - 5mM）的三重组合则能使 B9 培养基的稳定性至少提升 1.5 倍。同时，实验表明在添加 ALA、MC 或二者组合的 B8/B9 培养基中培养 BSCs 3 天，细胞形态未发生明显变化。
稳定剂的作用机制
为了深入了解稳定剂的作用机制，研究人员进行了一系列实验。首先，研究添加低浓度的 MC 和 L - ALA 对 GFs 降解的影响，发现 0.1g/L 的 MC 能部分延缓 rhHGF 和 rhPDGF 的降解。其次，研究人员测量了溶液的粘度，发现 0.1g/L MC 溶液的粘度比基础培养基高约 25%，这可能通过促进细胞黏附来提高细胞增殖率。此外，研究人员利用 NanoTemper Thermophoresis 测定法探究 MC 与 rhHGF 之间是否存在直接相互作用，结果显示在较宽的 MC 浓度范围内（0.00032nM 至 250nM），rhHGF 的构象变化不明显，表明 MC 对 GFs 的稳定作用可能并非源于特定的高能量相互作用。
筛选其他替代稳定剂
鉴于 MC 的合成性质引发了对其在食品中使用的担忧，研究人员开始探索其他潜在的稳定剂。他们筛选了多种食品级多糖和糖醇，发现山梨醇、玉米 / 大米淀粉等物质对细胞增殖率的影响与 B9 或 B8 + MC 相当。研究人员运用设计实验（DoE）方法，对多种稳定剂组合及其浓度进行优化。实验结果表明，在单一成分中，MC 在第 4 天和第 6 天对细胞增殖有显著影响，玉米淀粉（STC）的二次项（STC2）在第 1 天优势明显；在所有测试天数中，只有 MC 和 STC2的影响达到显著水平。在多成分组合中，MC 和山梨醇（SO）在第 8 天表现出一定的协同效应，但未达到显著水平。进一步实验验证发现，B8 中 MC 与 STC 的组合在促进细胞增殖方面表现最为稳定，其粘度比单独的 MC 和 STC 高约 100%，且 STC 对 rhHGF 无稳定作用，这表明高粘度可能通过物理性质而非稳定 GFs 来提高 BSCs 的增殖率。
稳定培养基中 BSCs 的长期增殖改善
长期增殖实验是评估新培养基效率的重要指标。研究人员对牛卫星细胞在优化后的 B8 和 B9 培养基中进行长期培养实验，监测每一代细胞的数量，并通过计算分化细胞的融合指数来评估细胞的成肌潜力。实验结果显示，与未添加 MC 的 B8 和 B9 培养基相比，添加 MC 的稳定 B8 培养基在后续传代中实现了更高的群体倍增数，稳定 B9 培养基从一开始就表现出更好的增殖效果。在分化培养基方面，HSA 是最佳的稳定剂，能使细胞达到最高的融合指数，但在 HSA 补充培养基中添加 MC 会对细胞分化效率产生负面影响，导致肌纤维缩短和融合指数降低；而在无 HSA 的培养基中，添加 MC 则能改善这两个参数。此外，研究还发现，在 B8 + MC 中添加 0.4g/L STC 可进一步提高细胞活力，促进成肌细胞融合；同时，稳定培养基稀释至原浓度的 70% 时，添加稳定剂仍能几乎完全补偿稀释对细胞增殖的影响，且分化后的肌肉纤维更厚更长。
稳定培养基适用于其他相关细胞系
考虑到细胞外基质（ECM）蛋白质成分在早期脊索动物中就已形成，研究人员推测他们的稳定剂混合物可能对其他物种的肌肉前体细胞增殖有类似作用。为此，他们对猪（PSCs）、鸡（CSCs）和鱼的卫星细胞进行了增殖实验。结果发现，与 BSCs 不同，PSCs 和 CSCs 在无 HSA 的 B8 + MC 培养基中实现了最成功的长期增殖。对于 PSCs，额外添加 rhHGF + rhPDGF 对细胞增殖和活力有积极趋势，但对 CSCs 无此效果。在鱼类细胞系方面，研究人员对大西洋鲭鱼（Scomber scombrus）骨骼肌细胞系（MACK1）和欧洲鲈鱼（Dicentrarchus labrax）胚胎样细胞系（DLEC）进行研究，发现 B8 培养基对 MACK1 细胞系的适用性高于 DLEC 细胞系，但无法完全替代胎牛血清（FBS） ，且添加 MC 和 HSA 对 MACK1 细胞增殖有负面影响。
稳定培养基适用于工业相关细胞系
中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系在生物技术产业中广泛应用，用于生产多种重组产品。研究人员推测 MC/HSA 在低浓度下稳定蛋白质的能力也可应用于 CHO 细胞培养。他们在无血清 CD - CHO 生长培养基中添加 0.1g/L MC 或 0.1g/L MC 与 0.8g/L HSA 的组合，对表达 Epo - Fc 的 CHO - DUXB11 细胞系进行适应性培养。结果显示，从第 5 天（120 小时）起，含 MC 的样本与生长培养基（GM）之间的 Epo - Fc 滴度差距增大，表明 MC 对细胞活力有积极影响，且添加剂对 EpoFc 与 Octet 传感器的结合无影响。对于另一种工业相关细胞系 Vero 细胞，研究发现较高浓度的 MC 在 B8 和商业培养基 VPSFM 中有轻微负面影响，但 B8 可成功替代更昂贵的 VPSFM 培养基，且稀释策略显示 80% 和 70% 的 VPSFM 比 100% 的 VPSFM 更能促进细胞增殖。
综上所述，研究人员通过一系列实验，成功找到了多种可替代血清白蛋白的食品级、低成本培养基稳定剂，如 MC、ALA、STC 等。这些稳定剂不仅能有效稳定培养基成分，促进多种细胞系的增殖，还能显著降低培养基成本，最高可使某些细胞系的培养基成本降低 73%。同时，研究还揭示了稳定剂的作用机制，明确了不同细胞系对稳定剂组合的特异性反应。这一研究成果为培养肉产业突破血清白蛋白依赖的瓶颈提供了关键解决方案，有望加速培养肉技术的规模化应用，使其更接近市场。此外，该研究成果还可应用于医学研究和制药行业，支持 3R 概念（减少、替代和优化动物使用），降低生物制药成本，为生产更经济实惠的药物奠定基础 ，对生命科学和健康医学领域的多个方面都具有重要的推动作用。
