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在人类胚胎干细胞（hESCs）研究中，为探究核心多能性因子 OCT4 在人类原始多能性中的调控作用，研究人员开展相关研究。结果发现 ATR 是磷酸化 OCT4 的关键激酶，对维持人类原始多能性至关重要。这一成果为相关领域研究提供新方向。
在生命科学的神秘领域中，人类胚胎干细胞（hESCs）的研究一直备受关注。常规培养条件下，hESCs 呈现出植入后上胚层的特征，而在特定条件下，它能转化为类似植入前上胚层的 “原始多能性” 状态。核心多能性因子 OCT4 在调控多能性状态中意义重大，然而其在人类原始多能性中的潜在调控作用却如同隐藏在迷雾之中，亟待探索。此外，虽然已知多种信号通路对诱导和维持人类原始多能性至关重要，但原始态和启动态 hESCs 的翻译后修饰（PTM）图谱差异并不明确，这也为该领域的研究增添了诸多谜题。在这样的背景下，为了揭开这些谜团，浙江大学医学院附属第一医院等机构的研究人员勇挑重担，开展了一系列深入研究。
研究人员的努力取得了丰硕成果。他们发现 ATR 是磷酸化 OCT4 的关键激酶，在原始态 hESCs 中，ATR 的激酶活性水平高于启动态 hESCs。抑制 ATR 活性会显著阻碍启动态 hESCs 向原始态的诱导，还会增加原始态 hESCs 在紫外线（UV）和喜树碱（CPT）处理后的早期凋亡死亡。这一发现揭示了 ATR 活性在维持人类原始多能性中的重要作用，暗示了 OCT4 磷酸化、DNA 损伤感知和修复系统在早期发育中调控不同多能性状态的潜在关联，为干细胞研究领域开辟了新的方向，也为相关疾病的治疗和再生医学的发展带来了新的希望 。该研究成果发表在《Scientific Reports》上。
研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞层面，通过培养人类胚胎干细胞系 H1 及构建 TAP-OCT4 H1 细胞系，为后续研究提供细胞模型。利用免疫沉淀（IP）技术富集 OCT4 蛋白，结合液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）分析，精确鉴定 OCT4 蛋白的磷酸化位点。借助蛋白质印迹（Western blotting）、定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）等技术，检测相关蛋白和基因的表达水平，从而深入探究分子机制。
研究结果主要从以下几个方面展开：
- 诱导启动态 hESCs 转化为原始态 hESCs：利用RSeT=无饲养层培养基诱导 H1 hESCs，5 - 7 天出现圆顶状克隆。经 qRT-PCR 分析，多种原始多能性标记物转录水平升高，碱性磷酸酶（AP）染色显示原始态 H1 细胞单克隆形成能力增强，免疫荧光显微镜和蛋白质印迹证实原始态 H1 细胞中 KLF4 和 OCT4 蛋白水平更高，建立了可靠的原始态 hESCs 诱导体系。
- 构建 TAP-OCT4 H1 细胞用于 OCT4 蛋白磷酸化位点定位：采用 CRISPR/Cas9 技术构建 TAP-OCT4 H1 细胞，其表达的 TAP-OCT4 蛋白水平与未编辑的 OCT4 相当，且保留了亲本 H1 细胞的关键属性，为研究 OCT4 蛋白磷酸化位点奠定基础。
- OCT4 蛋白在原始态与启动态 hESCs 中的磷酸化位点定位：对原始态和启动态 TAP-OCT4 H1 克隆 9A10 细胞进行免疫沉淀和 LC-MS/MS 分析，确定了 OCT4 蛋白在两种状态下的磷酸化位点。发现 10 个启动态 hESCs 中的磷酸化位点，7 个原始态 hESCs 中的磷酸化位点，其中 S136 和 S180 是原始态 hESCs 特有的磷酸化位点。
- 鉴定 ATR 为对维持人类原始多能性至关重要的潜在激酶：运用生物信息学预测和定量磷酸蛋白质组学分析，结合机器学习算法 IKAP，发现 ATR 是原始态 hESCs 中 OCT4 磷酸化的关键激酶。抑制 ATR 活性会抑制原始多能性标记物的升高，影响原始态 hESCs 的诱导。
- ATR 在无细胞体系中磷酸化 OCT4-S180 位点：构建 OCT4 磷酸化缺陷突变体，在无细胞体系中进行实验。结果表明，S180 是 ATR 介导的主要磷酸化位点，且 ATR 与 OCT4 存在相互作用。
- ATR 保护原始态 hESCs 免受 DNA 损伤刺激诱导的细胞死亡：研究发现，UV 和 CPT 处理后，原始态 hESCs 中 pATR-S428 水平升高幅度更大，γH2AX 磷酸化水平较低。抑制 ATR 活性会增加原始态 hESCs 在 UV 和 CPT 处理后的早期凋亡死亡，说明原始态 hESCs 的存活更依赖 ATR。
研究结论表明，研究人员成功鉴定出 OCT4 蛋白在原始态和启动态 hESCs 中差异磷酸化的多个位点，明确了 OCT4-S180 和 OCT4-S136 分别是 ATR 介导的原始态 hESCs 中的主要和次要磷酸化位点，证实了 ATR 在维持人类原始多能性中的关键作用。在讨论部分，研究人员指出，虽然揭示了 ATR 在人类原始多能性诱导中的重要作用，但 ATR 在该过程中的潜在机制仍有待进一步研究，系统鉴定 ATR 在原始态 hESCs 中的上游调节因子和下游靶点将是未来研究的重要方向。这一研究成果不仅加深了人们对人类胚胎干细胞多能性调控机制的理解，更为相关领域的进一步探索提供了重要的理论依据和研究方向，对推动生命科学和医学领域的发展具有重要意义。
