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核黄素（维生素 B?）对细胞生长和功能至关重要，其转运由 RFVT1 - 3 介导。但 RFVTs 识别和转运核黄素机制不明。研究人员解析了人 RFVT2 和 RFVT3 结构，揭示其识别和转运机制及 RFVT3 的 pH 依赖活性机制，为理解相关生理病理提供依据。
在生命的微观世界里，核黄素（维生素 B?）就像一把神奇的钥匙，开启着细胞生长与功能的大门。它是黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的前体，而这两种物质作为众多酶的关键辅助因子，在细胞代谢的舞台上发挥着举足轻重的作用，从能量产生到生物大分子合成，再到对外源物质的处理，都离不开它们的身影。然而，人类自身无法合成核黄素，只能从食物中摄取，这就需要核黄素转运蛋白（RFVTs）来帮忙。
RFVTs 家族包括 RFVT1 - 3，它们在核黄素的吸收、分布和重吸收过程中扮演着关键角色，对维持体内核黄素的平衡起着至关重要的作用。不同的 RFVTs 在人体组织中有着特定的分布，比如 RFVT1 主要在胎盘和小肠表达，RFVT3 在睾丸、小肠、肾脏和胎盘等组织中高表达，而 RFVT2 则广泛分布，在大脑中表达量较高。但是，当核黄素平衡被打破，或者 RFVTs 出现功能障碍时，就会引发一系列健康问题，像多种酰基辅酶 A 脱氢酶缺乏症（MADD）、Brown - Vialetto - van Laere 综合征等。此外，RFVT1 - 3 在多种肿瘤中异常表达，这也让它们成为潜在的抗癌靶点。尽管 RFVTs 如此重要，但由于缺乏精确的结构信息，科学家们对其功能机制的理解受到了极大的限制，进一步的研究也难以推进。
为了攻克这些难题，来自东北农业大学生命科学学院、中国科学院物理研究所、清华大学药学院等多个国内研究机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们揭示了 RFVTs 的神秘面纱。
研究人员主要运用了冷冻电镜（cryo - EM）技术、分子动力学（MD）模拟技术以及定点突变和蛋白脂质体转运实验等方法。通过冷冻电镜技术，他们成功解析了人 RFVT2 和 RFVT3 与核黄素复合物在向外封闭和向内开放状态下的结构；利用 MD 模拟技术，对核黄素结合的详细差异进行了分析；定点突变和蛋白脂质体转运实验则帮助他们确定了关键氨基酸残基在转运过程中的作用。
研究结果如下：
- RFVT2 和 RFVT3 的功能特性：通过在 HEK293T 细胞中表达野生型（WT）RFVT2 和 RFVT3，研究人员发现它们都能显著积累 [13C] 核黄素。进一步研究表明，RFVT2 和 RFVT3 对核黄素具有相似的特异性，但 pH 依赖性不同。低 pH（5.5）能显著增强 RFVT3 的活性，而对 RFVT2 没有影响。研究人员还构建了带有标记的 RFVT2 和 RFVT3（RFVT2EM和 RFVT3EM），验证了它们保留了野生型的关键功能特性，适合用于结构研究。
- RFVT2 和 RFVT3 的晶体结构：利用冷冻电镜，研究人员得到了高质量的 RFVT2EM和 RFVT3EM的电子密度图，分辨率分别为 3.0 ? 和 3.3 ?。结构显示，RFVT2 呈向外封闭状态，其狭窄的中央腔向细胞外空间开放，核黄素部分嵌入其中；RFVT3 则为向内开放构象，结合的核黄素暴露于细胞质中。RFVT2 和 RFVT3 都由 11 个跨膜螺旋组成，具有不对称的 6 + 5 拓扑结构，并且与主要促进超家族（MFS）转运体有相似之处，但也有独特的结构特征。
- RFVTs 对核黄素的识别：在 RFVT2 和 RFVT3 中，核黄素被高度亲水的中央腔中的保守结合口袋识别。通过定点突变实验，发现色氨酸（Trp）和天冬酰胺（Asn）等关键残基在核黄素识别中起重要作用。此外，在向外封闭的 RFVT2 中还观察到可能的第二个核黄素结合位点，推测其可能是核黄素的对接位点或潜在的变构调节位点。MD 模拟分析表明，RFVTs 在细胞外侧暴露高亲和力位点用于核黄素加载，在内侧通过相对低亲和力位点促进底物释放。
- RFVT3 的低 pH 增强活性：研究发现，RFVT3 中特有的两个可质子化酸性残基 D119 和 E145 决定了其 pH 依赖活性。定点突变实验显示，D119C 和 E145Q 突变完全消除了 RFVT3 的 pH 依赖性。蛋白脂质体转运实验表明，质子在低 pH 下与核黄素共转运，促进了 RFVT3 的底物转运。
- RFVTs 的转运机制：通过对 RFVT2 和 RFVT3 结构的对比分析，研究人员推测 RFVTs 采用类似 MFS 转运体的交替 access 机制来运输核黄素。在向外开放状态下，RFVTs 通过结构中的氢键网络和盐桥稳定构象，高亲和力位点暴露于细胞外结合核黄素；结合核黄素后，引发局部构象变化，促进状态转变；在向内开放状态下，核黄素释放到细胞质中，随后 RFVTs 恢复到初始状态，完成转运循环。
研究结论和讨论部分指出，该研究解析了人 RFVT2 和 RFVT3 的结构，揭示了核黄素识别和转运的机制，以及 RFVT3 的 pH 依赖活性机制。这一成果对理解相关生理病理过程具有重要意义，比如解释了为什么 FMN 和 FAD 难以被 RFVTs 转运，以及 RFVT3 如何利用质子梯度在特定组织中高效摄取核黄素。此外，研究人员还将许多致病性突变映射到 RFVT2 和 RFVT3 的结构上，为进一步研究相关疾病的发病机制提供了重要线索。同时，利用 GFP - 纳米抗体作为标记成功解析蛋白结构的方法，也为研究其他小膜蛋白的结构提供了借鉴，有助于推动更广泛的生物学研究和潜在治疗方法的开发。
