PAF1C 介导的 CDK12/13 激酶激活：调控转录延伸与细胞命运的关键机制

本文聚焦 RNA 聚合酶 II（RNAPII）转录周期中 CTD 磷酸化的调控机制。研究发现 CDK12 和 CDK9 共磷酸化 CTD Ser2和 Ser5，PAF1C 的 CDC73 亚基激活 CDK12，其 KIM 基序对细胞增殖和转录延伸至关重要，为理解转录调控提供新视角。

　　

研究背景

RNA 聚合酶 II（RNAPII）负责转录蛋白质编码基因和非编码 RNA，转录过程包括起始、暂停、延伸和终止等步骤。转录周期中，RNAPII 的 C 末端结构域（CTD）磷酸化起着关键作用，它招募不同的转录共因子，协调转录相关事件，如 mRNA 剪接和切割 / 多聚腺苷酸化。CTD 包含 52 个七肽重复序列（Tyr₁-Ser₂-Pro₃-Thr₄-Ser₅-Pro₆-Ser₇），可被转录周期蛋白依赖性激酶（CDKs）磷酸化，如 CDK7、CDK9、CDK12 和 CDK13。虽然细胞周期 CDKs 的靶标和位点特异性由其特定的周期蛋白调控，但转录特异性 CDKs 与各自的周期蛋白持续结合，却能磷酸化相同的主要靶标 RNAPII。目前，转录特异性 CDKs 在转录周期中的调控机制仍不明确，尤其是 CDK12 和 CDK13 及其调控方式，以及 RNAPII 磷酸化模式的形成机制。

研究结果

1. CDK12 和 CDK9 生成 Ser₂和 Ser₅双磷酸化的 RNAPII CTD：研究人员建立了体外系统，使用纯化的重组因子研究 CDK12/13 介导的磷酸化特异性和机制。实验发现，CDK12 和 CDK13 能使 CTD 发生超磷酸化，且 CDK12 的 N 末端富精氨酸 - 丝氨酸（RS）结构域对其激酶活性至关重要，该结构域通过稳定与 CTD 的结合促进 CDK12 活性。进一步研究表明，CDK12 和 CDK9 能在高度偶联的反应中生成 Ser₅P 和 Ser₂P，产生 Ser₂P-Ser₅P 双磷酸化标记，且 Ser₂P 单磷酸化在 Ser₅P 去磷酸化后才容易检测到。在细胞实验中，抑制 CDK12/13 会导致 Ser₂P-Ser₅P 水平显著下降，而 SSU72 介导的 Ser₅P 去磷酸化能增加 Ser₂P 信号，说明 Ser₂P 可能来源于 Ser₂P-Ser₅P 标记的去磷酸化。
2. PAF1C 的 CDC73 亚基通过直接相互作用特异性激活 CDK12：研究证实了延伸因子 PAF1C 与 CDK12 的相互作用，且该相互作用是直接的，通过 CDK12 激酶结构域和 / 或周期蛋白 K 发生。体外激酶实验表明，PAF1C 能显著刺激 CDK12 的活性，而对 CDK9 无刺激作用。进一步研究发现，PAF1C 的 CDC73 亚基是激活 CDK12 的关键，缺失 CDC73 亚基的 PAF1C 无法刺激 CDK12 反应，单独的 CDC73 亚基则足以刺激 CDK12 活性。
3. CDC73 的一个基序与 CDK12 / 周期蛋白 K 相互作用促进 T 环打开：利用 AlphaFold-Multimer 进行蛋白质折叠预测，发现 CDC73 的一个短基序（残基 290 - 324）与 CDK12 激酶结构域和周期蛋白 K 相互作用，该基序被命名为周期蛋白 K 相互作用基序（KIM）。KIM 能与 CDK12 的激活 T 环直接接触，促进其开放构象，为 CDC73 对 CDK12 的别构激活提供结构基础。多个物种间的序列比对显示，CDC73-KIM 高度保守。实验验证表明，缺失 KIM 或突变关键位点（Y290A 和 Y293A）的 CDC73 会导致 CDK12 激酶活性丧失，以及 PAF1-CDK12 / 周期蛋白 K 相互作用减弱。
4. CDC73-KIM 对正常 CTD 磷酸化、转录延伸和细胞增殖至关重要：在细胞实验中，研究人员建立了 “切换” 系统，通过 siRNA 敲低内源性 CDC73，诱导表达不同的重组 CDC73。结果显示，敲低 CDC73 会导致细胞增殖丧失，而表达野生型 CDC73 可挽救这一表型，表达缺失 KIM 或突变的 CDC73 则无法挽救，说明 PAF1C 与 CDK12/13 的相互作用对细胞增殖至关重要。通过瞬时转录组测序（TT_chem-seq）分析发现，CDC73 缺失或其 KIM 突变会导致转录在基因体和 3' 端的活性相对丧失，尤其是长基因，且会影响 CTD 磷酸化水平。进一步的差异基因表达分析表明，这些缺陷导致转录的全局下调，且基因长度与下调程度直接相关，长基因受影响更大，而短基因有时会出现上调。此外，CDC73-KIM 突变还会影响长基因的蛋白质表达。

研究讨论

1. CTD Ser₂P-Ser₅P 双磷酸化：CTD Ser₂-Ser₅双磷酸化在转录生物学中可能具有重要意义。一方面，它可能允许特定的 CTD 结合结构域与之相互作用，如 SETD2 中的 SRI 结构域或 SCAF4 和 SCAF8 中的某些 CTD 相互作用结构域（CIDs）。另一方面，它可能作为 Ser₂P CTD 标记的前体，通过 Ser₅P 去磷酸化产生 Ser₂P。研究人员认为，CDK9 可能是起始的 Ser₅P-Ser₂P 激酶，而 CDK12/13 则在转录延伸过程中维持和扩展这一 CTD 标记，特别是在人类长基因的转录中。酵母和人类细胞中 CDK12/13 功能的差异可能与基因长度有关，酵母基因较短，Ctk1（CDK12/13 的酵母同源物）的活性并非必需，而人类基因较长，CDK12/13 对转录延伸至关重要。
2. PAF1C 激活 CDK12/13：PAF1C 通过 CDC73 亚基的 KIM 基序与 CDK12/13 结合并特异性激活它们，这对细胞生长、CTD 磷酸化和转录尤其是长基因的转录至关重要。PAF1C 介导的 CDK12/13 激活有助于加速 RNAPII 延伸，与 PAF1C 在转录延伸和持续性方面的重要作用一致。此外，CDK12 的活性对 PAF1C 与 RNAPII 的结合也很重要，二者之间的相互作用机制仍有待进一步研究。目前，CDK12/13 是癌症治疗的潜在靶点，该研究为设计针对 CDC73-CDK12 / 周期蛋白 K 相互作用的肽抑制剂提供了可能。
3. 研究局限性：本研究主要关注 CTD 的 Ser₂和 Ser₅磷酸化位点，其他位点如 Thr₄和 Ser₇可能也会影响 CTD 磷酸化模式，有待进一步研究。在体外研究 Ser₂P 形成时，仅选择了 SSU72 作为研究对象，其他 CTD 磷酸酶在体内 Ser₂P 形成中的作用尚不明确。研究中的结构模型基于 AlphaFold 预测，虽经实验验证，但仍需实验生成的结构模型来进一步确认和扩展。研究中使用的敲低和切换系统只能观察到 CDC73-KIM 突变的中长期后果，未来需要更快的基于降解子的方法来研究其短期直接后果。此外，CDK7 对 CDK9 和 CDK12 的 T 环磷酸化是否与 CDC73 对 CDK12 的别构激活协同作用也有待解决。