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这篇研究发现，全身组织中的通用成纤维细胞（如肺、结肠、肌肉来源）可分化为造血干细胞（HSCs）龛细胞（CAR 细胞）。通过异位骨形成和骨髓内移植实验验证，为理解造血微环境及相关疾病治疗提供新思路。
研究背景
成纤维细胞是一类非造血、非内皮、非上皮、非实质细胞，能分泌结构和信号分子，支持器官功能。在骨髓中，CXCL12 丰富的网状细胞（CAR 细胞），与瘦素受体表达细胞（LepR+细胞）高度重叠，是造血干细胞（HSCs）龛的主要细胞成分 ，对维持 HSCs 的存活和增殖至关重要。CAR/LepR+细胞具有特定的细胞因子和转录因子表达特征，如 CXCL12、干细胞因子（SCF）、Foxc1、Ebf1/3、Runx1/2 等。
有研究通过对多个组织的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据集进行荟萃分析，提出存在通用成纤维细胞，其可分化为多种组织特异性的成纤维细胞亚群，包括 CAR 细胞，但缺乏直接证据支持这一假说。本研究旨在探究通用成纤维细胞是否能在体内分化为骨髓特异性的 CAR 细胞。
实验方法
- 细胞分离与鉴定：从肺、结肠和肌肉中分离细胞，通过流式细胞术分选出不同细胞群体，包括通用成纤维细胞（PDGFRα+Sca-1+CD34+CD45?Ter119?CD31?EpCAM?）、壁细胞（PDGFRα?PDGFRβ+CD45?Ter119?CD31?EpCAM? ）等，并利用定量实时聚合酶链反应（real-time RT-qPCR）分析基因表达情况。
- 体内实验
- 异位骨形成实验：将 Ubc-GFP 转基因小鼠（所有细胞表达可追踪的报告基因 GFP）与 CXCL12-tdTomato 小鼠（CXCL12 位点敲入串联二聚体番茄报告基因）杂交，分选出 GFP+的通用成纤维细胞和壁细胞，与含骨形态发生蛋白 2（BMP2）的基质胶混合后，植入野生型小鼠胫骨前肌中部。8 周后，分析异位骨的形成情况、细胞组成及功能。
- 骨髓内移植实验：从 Ubc-GFP;CXCL12-tdTomato 小鼠的肺、结肠和肌肉中分离 GFP+通用成纤维细胞，通过骨髓内注射到致死性照射的受体小鼠体内。9 - 14 周后，对受体小鼠骨髓进行分析。
- 单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）：对移植肺通用成纤维细胞 12 天后的异位骨和肺组织进行 scRNA-seq，分析细胞分化轨迹。同时，对发育中的骨骼和新生小鼠进行组织学和基因表达分析，探究通用成纤维细胞与 CAR 细胞祖细胞的关系。
实验结果
- 通用成纤维细胞的分离与特征：成功从肺、结肠和肌肉中分离出通用成纤维细胞，其表达高水平的 Dpt 基因，但不表达 CAR 细胞的特征基因。肺和肌肉的通用成纤维细胞富含 Pi16+簇，结肠的通用成纤维细胞富含 Col15a1+簇。此外，发现 CD248 是通用成纤维细胞的一个特异性表面标记物。
- 通用成纤维细胞的定位：在肺中，PDGFRα+Sca-1+通用成纤维细胞表达 CD248，主要定位于支气管血管束周围的外膜袖带；在结肠中，PDGFRα+CD34+通用成纤维细胞位于固有层、黏膜肌层、外肌层和浆膜；在骨骼肌中，PDGFRα+Sca-1+通用成纤维细胞表达 CD248，分布于肌纤维束周围的间质和单个肌纤维周围。
- 异位骨形成实验结果：异位骨形成实验中，移植通用成纤维细胞的小鼠形成了含有骨髓的异位骨，其中存在功能性 HSCs。流式细胞术和组织学分析表明，肺、结肠和肌肉来源的通用成纤维细胞在异位骨中分化为 CAR 细胞，这些细胞表达高水平的 HSC 龛因子，且能与 c-kit+原始造血细胞接触，为 HSPCs 创造龛环境。
- 分化轨迹分析：scRNA-seq 结果显示，肺通用成纤维细胞在异位骨形成过程中的分化轨迹是从通用成纤维细胞簇（C1）开始，经过 CAR 细胞簇（C2），最终到达成骨细胞簇（C3）。
- 骨髓内移植实验结果：骨髓内移植实验中，肺、结肠和肌肉来源的通用成纤维细胞在受体小鼠骨髓中分化为 CAR 细胞，这些细胞表达 HSC 龛因子，且能与 c-kit+原始造血细胞接触。不同组织来源的通用成纤维细胞分化为 CAR 细胞的潜力存在差异。
- 胚胎发育中的发现：在胚胎发育过程中，PDGFRα+Sca-1+通用成纤维细胞在胚胎第 17.5 天出现在骨膜附近，且表达通用成纤维细胞标记基因。在 Runx1 和 Runx2 基因敲除的新生小鼠中，PDGFRα+Sca-1+CD248+通用成纤维细胞数量增加，而 PDGFRβ+ CAR 细胞祖细胞未被检测到，提示 Runx1 和 Runx2 在 CAR 细胞祖细胞分化中起作用。
研究讨论
本研究首次提供直接证据表明，全身多种组织（肺、结肠、肌肉）中远离骨髓的通用成纤维细胞，在体内具有分化为骨髓特异性 CAR 细胞的潜力。虽然之前有研究表明成纤维细胞可分化为其他间充质细胞类型，但未证明其能分化为具有 HSC 龛细胞特性的细胞。
研究还发现，CD248 可能是富集具有分化为 CAR 细胞潜力的通用成纤维细胞的有用标记物，尤其在结肠组织中。通用成纤维细胞与间充质干细胞（MSCs）在标记物表达上有重叠，本研究结果提示通用祖细胞可能通过 CAR 细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞。
此外，BMP2 和 / 或 BMP4 可能诱导通用成纤维细胞分化为 CAR 细胞，但真正的骨髓中似乎存在未知因子，对 CAR 细胞的成熟至关重要。同时，研究推测通用成纤维细胞可能需要 Runx1 或 Runx2 来生成 Foxc1 表达的 CAR 细胞祖细胞。
本研究为理解成纤维细胞谱系和组织干细胞龛的本质提供了重要依据，但也存在一些局限性。例如，通用成纤维细胞来源的 CAR 细胞与成年骨髓 CAR 细胞的特征不完全相同；缺乏遗传证据支持胎儿骨膜附近的通用成纤维细胞在生理条件下产生 CAR 细胞祖细胞的假设；CD248 作为富集通用成纤维细胞的有用标记物缺乏直接证据；还需进一步确定促使通用成纤维细胞分化为成年骨髓 CAR 细胞的细胞外和细胞内分子。
总体而言，本研究为后续深入探究成纤维细胞的分化机制、组织干细胞龛的形成以及相关疾病的治疗提供了有价值的起点，有望在再生医学和血液疾病治疗领域带来新的突破。
