揭秘果蝇生物钟调控新机制：dPPIL4 如何掌控 PER 振荡维持昼夜节律

在生物钟调控研究中，为探究肽基 - 脯氨酰顺反异构酶（PPIases）对昼夜节律的影响，研究人员以果蝇为模型研究 dPPIL4。结果发现 dPPIL4 通过调节 PER蛋白合成与降解，维持高振幅振荡，调控昼夜节律。这为理解生物钟机制提供新视角。

　　在奇妙的生命世界里，生物钟就像一个精准的 “体内时钟”，掌控着生物体约 24 小时的生理和行为节律，使其能与外界环境的光暗、温度变化同步。在分子和细胞层面，生物钟的运转依赖转录 - 翻译反馈回路（TTFLs），核心时钟蛋白在其中发挥关键作用 。然而，尽管对生物钟的研究不断深入，仍有许多谜团待解。例如，肽基 - 脯氨酰顺反异构酶（PPIases）这类在细胞过程中广泛参与的酶，是否也在生物钟调控中扮演重要角色？此前虽有研究发现部分 PPIases 相关蛋白对生物钟有影响，但具体机制尚不明确。为了揭开这些谜团，韩国 Ajou 大学医学院的研究人员开展了深入研究。他们以果蝇为研究对象，聚焦于一种名为果蝇肽基 - 脯氨酰顺反异构酶样 4（dPPIL4）的蛋白，致力于探究其在昼夜节律调控中的作用机制。最终，研究人员发现 dPPIL4 在调节果蝇昼夜节律中至关重要，该研究成果发表在《iScience》上，为我们理解生物钟调控机制打开了新的窗口。

研究人员在此次研究中主要运用了以下几种关键技术方法：一是行为学分析，通过观察果蝇在不同条件下的运动活性节律，判断其昼夜节律是否异常；二是实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR），用于检测基因的 mRNA 和 pre - mRNA 水平，了解基因转录情况；三是免疫沉淀（IP）和免疫印迹（Western blotting）技术，前者用于验证蛋白间的相互作用，后者则可分析蛋白的表达和修饰水平；四是 RNA 测序（RNA - Seq），全面分析基因表达变化。

研究结果如下：

• dppil4 下调延长果蝇自由运行周期：研究人员利用 Gal4 - UAS 系统对果蝇基因组中的 23 个 PPIase 基因进行 RNA 干扰（RNAi）筛选，发现下调 dppil4 会使果蝇昼夜节律周期延长。通过多种实验方法验证，如使用不同的 dppil4 RNAi 品系、构建 dppil4 功能缺失突变体果蝇、运用温度敏感的 GAL80 抑制 GAL4 活性的 TARGET 系统等，均证实 dPPIL4 在时钟细胞中对调节昼夜节律周期不可或缺。
• dPPIL4 在脑细胞中广泛表达且定位于细胞核：研究显示，dppil4 mRNA 和 dPPIL4 蛋白水平在一天中保持恒定，且 dPPIL4 在包括时钟神经元在内的脑细胞中广泛表达，主要定位于细胞核。免疫染色实验表明，dPPIL4 在多种时钟神经元，如 sLN_Vs、ILN_s、LN_ds 和 DN1s 中均有表达 。
• PER 水平降低是 dPPIL4 KD 果蝇长周期的原因：在时钟神经元网络中，sLN_Vs 对控制自由运行节律起关键作用。研究发现，dppil4 KD 果蝇的 PER 水平全天显著降低，振荡相位延迟，而 TIM、CLK 和 VRI 水平与对照组相比无明显差异。过表达 UAS - per 转基因可部分挽救 dppil4 KD 果蝇的长周期表型，说明 dPPIL4 通过影响 PER 水平控制果蝇昼夜节律速度。
• dPPIL4 调节 per RNA 和蛋白水平：测量 per 的 pre - mRNA 和 mRNA 水平发现，dppil4 KD 果蝇中两者均降低，表明 dPPIL4 调节 per 转录。通过表达不同的 per 转基因，研究人员发现 dPPIL4 不调节 CLK/CYC 依赖的转录起始过程，且其对 PER 水平的调节依赖于 per 的基因组结构。此外，dPPIL4 似乎在清晨促进 PER 蛋白降解。
• dPPIL4 通过增强 RNAPII CTD 磷酸化支持 per 转录：鉴于 dPPIL4 影响 per 转录且其同源物在其他生物中调节 RNAPII 活性，研究人员检测了 RNAPII CTD 的磷酸化水平。结果发现，dppil4 KD 果蝇中 RNAPII CTD Ser5（pSer5）磷酸化水平在 ZT12 时降低，且 dPPIL4 与 RNAPII 存在物理相互作用，表明 dPPIL4 通过增强 RNAPII CTD Ser5 磷酸化支持 per 转录。RNA - Seq 分析显示，dPPIL4 KD 显著影响基因表达，尤其对 per 基因的转录调控影响明显。
• dPPIL4 稳定 Cullin1 促进 PER 降解：实验表明，dPPIL4 在清晨促进 PER 降解，且与 Cullin1（CUL1）存在物理相互作用，可稳定 CUL1，维持 SCF 复合体活性，确保 PER 等底物的正常降解。在 dppil4 KD 果蝇中，CUL1 水平降低，另一种 SCF 复合体底物 Cubitus interruptus（Ci）水平升高，进一步证实了 dPPIL4 在维持 SCF 复合体稳定性和功能方面的重要作用。

研究结论和讨论部分指出，dPPIL4 作为环孢菌素蛋白家族成员，在果蝇昼夜节律调控中发挥关键作用。它通过双机制调节昼夜节律：在时钟细胞核中，dPPIL4 在中午增强 RNAPII 活性，支持 per 转录；同时，通过增加 CUL1 水平稳定 SCF 复合体，在清晨促进 PER 降解。这两个过程共同产生高振幅的 PER 振荡，对维持 24 小时的稳健节律至关重要。该研究不仅揭示了 PPIase 参与生物钟调控的机制，还首次发现 dPPIL4 在时间依赖的方式下调节时钟组件的 RNA 和蛋白水平。由于时钟蛋白高振幅振荡的维持对生物钟稳健性至关重要，而昼夜节律振幅的减弱与衰老和多种疾病相关，因此该研究为探索针对功能失调的昼夜节律系统的治疗干预措施提供了新的可能性。不过，研究也存在一定局限性，如 dPPIL4 对 RNA Pol II 和 CUL1 的异构化作用未得到证实，未来还需进一步研究来明确 dPPIL4、RNA Pol II/CUL1 与昼夜节律调控之间的直接联系。