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这篇研究聚焦膀胱癌，发现外周血 T 细胞受体（TCR）多样性和 T 细胞比例与患者预后密切相关。低 TCR 多样性及低 T 细胞比例预示不良预后，且 TCR 多样性还影响肿瘤生物学。该研究为膀胱癌治疗及患者分层提供新思路。
研究背景
癌症的发生发展与免疫系统功能息息相关，T 细胞作为适应性免疫系统的关键组成部分，在机体对抗肿瘤的过程中发挥着重要作用。T 细胞通过其表面独特的 T 细胞受体（TCR）识别抗原，进而启动免疫反应。TCR 由 DNA 重排产生，不同的 T 细胞克隆拥有不同的 TCR，这使得 T 细胞能够对多种多样的抗原产生特异性免疫应答。分析 TCR 库（TCR repertoire）可以评估 T 细胞克隆的多样性和状态，从而了解免疫系统的功能。
膀胱癌是一种具有高免疫原性的疾病，其肿瘤突变负担较高，肿瘤微环境中有大量免疫细胞浸润，并且会形成三级淋巴样结构。目前，膀胱癌的治疗方式根据癌症的侵袭性进行分层，高风险非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）通常采用卡介苗（BCG）免疫治疗，而局部肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）则多采用铂类新辅助化疗联合根治性膀胱切除术。然而，部分患者对这些治疗方法的反应不佳，且治疗后的复发和转移问题仍然严峻。因此，深入了解膀胱癌患者的免疫状态，寻找与预后相关的生物标志物，对于优化治疗策略具有重要意义。此前研究虽已发现 TCR 库与多种癌症患者的预后有关，但在膀胱癌中的作用尚未完全明确，TCR 库在治疗过程中的动态变化以及与肿瘤生物学的相互作用也有待深入探究。
研究方法
- 样本采集与处理：研究纳入了 119 例 MIBC 患者和 30 例 NMIBC 患者。对患者的肿瘤活检组织和纵向血液样本进行 TCR 测序（TCR-seq），同时结合之前研究中的全外显子测序（WES）、全基因组测序（WGS）和转录组测序（RNA-seq）数据进行分析。患者的治疗和随访遵循丹麦奥胡斯大学医院的标准临床指南。
- 数据分析方法：利用多种生物信息学工具和统计方法对测序数据进行深入分析。通过计算标准化香农多样性指数来量化 TCR 多样性，使用 TcellExTRECT 方法基于种系 WES 数据确定循环中 T 细胞的相对比例。此外，还运用了多种软件对基因表达、突变数据等进行分析，以探究 TCR 库与临床结局、肿瘤生物学之间的关系。
研究结果
- TCR 多样性、T 细胞比例与膀胱癌患者预后的关系
- 在 MIBC 患者中，治疗前外周血 TCR 多样性较低的患者总生存期（OS）明显较短（风险比 [HR]=2.3，p = 0.024），无复发生存期（RFS）也较短，但未达到统计学意义（HR = 1.7，p = 0.22）。同时，T 细胞比例低于中位数的患者 OS（HR = 3.3，p = 0.0075）和 RFS（HR = 4.2，p = 0.016）也显著缩短。综合分析显示，TCR 多样性和 T 细胞比例均低于中位数的患者预后更差（OS 的 HR = 4.7，p = 0.00049；RFS 的 HR = 3.2，p = 0.043） 。在独立队列（TCGA 和 IMvigor210 队列）中也验证了这些结果。
- 在 NMIBC 患者中，TCR 多样性在 BCG 免疫治疗后，与患者的无进展生存期（PFS）相关。治疗后 TCR 多样性低的患者 PFS 较短（HR = ∞，p = 0.015），且 T 细胞比例较低的患者 PFS 也较短（HR = 3.8，p = 0.027）。
- TCR 克隆扩增情况：MIBC 患者化疗前 TCR 克隆扩增存在显著差异，T 细胞克隆分为小的非扩增克隆和大的超扩增克隆。超扩增克隆虽然数量仅占总独特 T 细胞克隆的 0.34%，但却占总 T 细胞比例的 17.25%。TCR 多样性与超扩增 T 细胞克隆的比例呈强烈负相关（r = -0.98，p < 0.0001），表明低 TCR 多样性主要由超扩增克隆数量增加所致。
- 超扩增克隆的抗原靶点及相关因素：超扩增 T 细胞克隆的 TCR 更有可能具有推断的抗原靶点，且显著倾向于靶向爱泼斯坦 - 巴尔病毒（EBV）和巨细胞病毒（CMV）抗原。在患者中，检测到 CMV DNA 与较低的 TCR 多样性相关（p = 5.3×10-5），但 CMV 感染与疾病预后无明显关联。
- TCR 库在疾病过程中的动态变化：对部分 MIBC 患者的纵向血液样本分析发现，超扩增克隆在疾病过程中高度持久，多数超扩增克隆在基线时被检测到后，在后续样本中仍可检测到。治疗会影响 TCR 多样性和淋巴细胞计数，非转移性患者在治疗过程中 TCR 多样性下降，淋巴细胞计数也持续减少，而转移性患者则未观察到明显变化。在 NMIBC 患者中，BCG 免疫治疗后，有良好结局的患者 TCR 多样性增加。
- TCR 多样性与肿瘤生物学的关系：通过对肿瘤活检组织的 RNA-seq 和 WES 数据研究发现，低 TCR 多样性患者的基因表达主要与细胞外基质组织或信号转导相关，而高 TCR 多样性患者的基因表达与蛋白质或 RNA 代谢有关。此外，低 TCR 多样性患者的循环肿瘤 DNA（ctDNA）阳性率更高，提示其肿瘤发生转移的风险可能更高。
- 肿瘤与外周血 TCR 库的差异：肿瘤 TCR 库与外周血 TCR 库存在明显差异，肿瘤 TCR 库的克隆数量更少、多样性更低。虽然血液中的超扩增克隆常存在于肿瘤中，但似乎并未在肿瘤微环境中富集，肿瘤微环境可能主要由循环至血液受限的 T 细胞组成。
- T 细胞亚型分析：通过单细胞 RNA-seq 对配对的肿瘤和血液样本进行分析，发现血液中的超扩增克隆主要为终末分化的效应记忆 T 细胞，且具有高细胞毒性基因表达，而非扩增克隆主要为幼稚 T 细胞。这一结果在对 8 例 MIBC 患者的 RNA-seq 分析中也得到了支持，即低 TCR 多样性患者的幼稚与效应记忆 T 细胞比例更低。
研究结论
- TCR 多样性和 T 细胞比例是膀胱癌预后的重要指标：本研究全面分析了膀胱癌患者的 TCR 库，发现外周血 TCR 多样性和 T 细胞比例与患者的生存结局密切相关。这两个指标可能反映了免疫系统靶向癌症新抗原、抑制肿瘤生长的内在能力，独立于化疗的细胞毒性作用。高 TCR 多样性和 T 细胞比例可能增加肿瘤新抗原被匹配 TCR 识别的概率，从而增强抗肿瘤免疫反应，改善患者预后。
- 病毒感染对 TCR 多样性的影响：超扩增 T 细胞克隆主要靶向 EBV 和 CMV 等潜伏病毒感染的抗原。CMV 感染虽会显著降低 TCR 多样性，但与膀胱癌患者的预后并无直接关联。这表明病毒感染与免疫系统及肿瘤之间的关系较为复杂，需要进一步深入研究。
- 治疗对 TCR 多样性的双重影响：化疗会对患者的 TCR 多样性和淋巴细胞计数产生负面影响，尤其是对原本 TCR 多样性较高、预后较好的患者。这可能导致免疫系统对新病原体的反应能力下降，增加患者感染和患其他癌症的风险。而在早期膀胱癌患者中，BCG 免疫治疗可使有良好结局的患者 TCR 多样性增加，反映了 BCG 治疗的免疫刺激作用。这提示在临床治疗中，应根据患者的免疫状态合理选择治疗方案，避免过度治疗对免疫系统造成损害。
- TCR 多样性与肿瘤生物学的相互作用：TCR 多样性不仅与患者预后相关，还影响肿瘤生物学。低 TCR 多样性与肿瘤细胞外基质组织相关基因的高表达有关，这可能促进癌症进展和转移。此外，肿瘤与外周血 TCR 库的差异表明，两者具有不同的生物学特性，进一步研究两者之间的关系有助于深入理解肿瘤免疫逃逸机制。
- 对临床治疗的启示：基于本研究结果，TCR 多样性等评估免疫能力的指标可能对免疫治疗反应具有高度预测性。免疫功能良好、TCR 多样性高的患者可能从免疫增强疗法（如免疫检查点抑制剂）中获益更多；而化疗策略可能更适用于 TCR 多样性低、免疫功能较弱的患者。未来的临床研究应致力于将免疫能力评估整合到精准医学方法中，以优化抗癌治疗方案，提高患者生存率。
研究局限性
- 在 TCGA 和 IMvigor210 队列的验证分析中，由于缺乏 TCR-seq 数据，TCR 多样性是通过种系 WES 数据估计的，这可能导致 T 细胞克隆的回收率较低，影响结果的准确性。
- TCR 靶点推断仅使用了 CDR3β 链，相比使用两条链的方法准确性较低。此外，由于 TCR - 抗原对的可用性有限，大部分 TCR 的靶点仍未知，这限制了对 T 细胞功能的深入理解。
- EBV 在人群中普遍存在，其对 TCR 多样性的影响在本研究中难以准确量化，可能导致研究结果存在一定偏差。
