重组 EtpA 糖蛋白的肠胃外疫苗接种可抑制产肠毒素大肠杆菌定植：开拓疫苗研发新方向

这篇研究聚焦产肠毒素大肠杆菌（ETEC）疫苗研发难题。通过对小鼠实验，发现肌肉注射重组 EtpA（rEtpA）能引发黏膜抗体反应，且免疫效果受接种时间影响。铝佐剂 rEtpA 接种也有保护作用，为 ETEC 疫苗开发提供新思路。

　　

引言

产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是大肠杆菌的一种致泻性致病变种，能产生热不稳定和 / 或热稳定肠毒素。它是中低收入国家（LMICs）幼儿腹泻的主要病因，也是前往卫生条件有限地区旅行者腹泻的常见原因，还会导致儿童死亡以及多种非腹泻性后遗症，如微量营养素缺乏、营养不良和生长发育受损等。

目前多数 ETEC 疫苗研发集中在质粒编码的定植因子（CFs）上，但 ETEC 抗原具有异质性，理想的疫苗应具备广泛保护作用、能预防幼儿中重度腹泻且易于与现有疫苗联合使用。多数肠道疫苗采用口服递送方式，但患有肠病的儿童对口服疫苗反应不佳，而肠胃外亚单位疫苗能诱导有效的黏膜免疫反应，或可克服口服疫苗的局限性。

EtpA 是一种高分子量细胞外 ETEC 糖蛋白黏附素，能与肠道上皮细胞上的 A 血型聚糖结合，促进细菌黏附和毒素递送。表达 A 血型抗原的儿童和成人感染 ETEC 的风险更高。此前研究发现，通过鼻内、口服和舌下途径接种重组 EtpA 可在小鼠模型中预防肠道定植，本研究则探索了肌肉注射 EtpA 作为肠胃外给药抗原亚单位的效用。

材料和方法

1. 重组 EtpA 生产：从 - 80°C 保存的甘油冻存管中复苏 Top10（pJL017, pJL030），在含相应抗生素和葡萄糖的 terrific broth 中过夜培养，次日稀释培养，待 OD₆₀₀达到约 0.6 时，用阿拉伯糖诱导表达，经离心、过滤、浓缩后，通过金属亲和色谱柱纯化，进行内毒素去除，最终透析、浓缩并测定内毒素水平。
2. EtpA 生物素化：rEtpA 与 NHS-LC-LC - 生物素在室温反应，用 Tris 终止反应，透析去除游离生物素，通过免疫印迹确认生物素掺入。
3. 酶联免疫吸附测定（ELISA）：包括 EtpA ELISA、IgG 亲和力测定、血型 A-EtpA 结合 ELISA，各实验步骤包括包被、封闭、加样、洗涤、加二抗、显色和读数等，具体操作因实验目的而异。
4. 肌肉接种：小鼠分别接种 10 μg rEtpA 和 1 μg 双突变 LT（dmLT）、1 μg dmLT 或 PBS，按不同免疫时间表接种；部分小鼠接种磷酸铝佐剂（Adju-Phos）单独或与 rEtpA 混合制剂。
5. 小鼠小肠定植实验：用链霉素处理成年 CD-1 小鼠，接种 jf876 菌株，次日取小肠段处理并计数菌落形成单位。
6. ETEC 对血型 A 肠道上皮细胞的黏附实验：在表达 A 血型聚糖的 HT-29 细胞上进行黏附实验，可通过平板计数或共聚焦显微镜观察。
7. 共聚焦激光扫描显微镜：HT-29 细胞在培养条件下生长至汇合，接种 ETEC H10407，染色后用共聚焦显微镜成像。
8. 电子显微镜：包括负染色电子显微镜多克隆表位作图（nsEMPEM）样品制备、数据采集和处理，对不同时间接种小鼠血清中纯化的 IgG 进行处理，制备 rEtpA-Fab 复合物，收集数据并处理分析。

结果

1. 肠胃外疫苗接种引发对 EtpA 的黏膜反应：肌肉注射 rEtpA 和 dmLT 的小鼠产生了针对 EtpA 的粪便 IgA 和 IgG 反应，且 ETEC 感染后，免疫小鼠的黏膜抗体反应显著增加，而 PBS 对照组无反应，表明肠胃外接种 rEtpA 可引发黏膜抗体反应并增强感染后的抗原反应。
2. dmLT 与铝佐剂的比较：接种含 dmLT 或铝佐剂的 rEtpA 疫苗后，小鼠血清中均产生适度的 IgA 反应和强烈的 IgG 反应。dmLT/rEtpA 免疫小鼠在感染后粪便 IgA 有适度增加，铝佐剂组无变化；两组粪便 IgG 均增加，dmLT-EtpA 组合组更高。
3. rEtpA 肠胃外接种时间决定结果：按 0、14、28 天免疫小鼠并于 44 天攻毒，虽产生 IgG 为主的反应，但对肠道定植无显著保护作用；按 0、21、42 天免疫并于 63 天攻毒，小鼠血清 IgG 反应更强，能保护小鼠免受 ETEC 肠道定植，且抗体亲和力更高，更有效阻止 EtpA 与目标分子结合及细菌黏附。通过 nsEMPEM 发现，三周免疫样本中 Fab-EtpA 复合物的二维分类更丰富，包括多个 Fab 与 rEtpA 结合的情况，且能结合 C 末端重复域的中和表位。
4. 铝佐剂 rEtpA 肠胃外接种抑制 ETEC 定植：按 0、21、42 天接种铝佐剂 rEtpA 并于 63 天攻毒，小鼠血清和粪便中均产生以 IgG 为主的反应，虽 IgA 反应不明显，但接种小鼠的 ETEC 肠道定植水平降低，表明 rEtpA 作为肠胃外递送亚单位疫苗的一部分可提供保护。

讨论

ETEC 自发现以来给疫苗研发带来巨大挑战，其质粒编码的毒力基因存在于多种 O - 和 H - 血清群的大肠杆菌中，与血清型有限的霍乱弧菌不同。过去五十年，CFs 一直是疫苗研发的主要靶点，虽有研究表明针对 CFs 的疫苗有一定保护作用，但 ETEC 抗原的多样性使得仅基于 CFs 开发广泛保护的亚单位疫苗困难重重。

本研究表明，肠胃外接种 EtpA 是可行的，可扩大当前以 CFs 为中心的疫苗覆盖范围。非黏膜接种 dmLT 佐剂可诱导 CD4⁺抗原特异性 T 细胞和 B 细胞迁移到肠道黏膜，产生粪便 IgA；IgG 在保护肠道病原体感染中也起重要作用，可靶向表面毒力因子。本研究中，rEtpA 接种产生的粪便 IgG 反应可能足以靶向 EtpA 黏附素提供保护，且抗体的质量和数量可能取决于接种策略，但血清抗体不一定能准确反映黏膜表面的抗体情况。

目前，确定针对黏膜病原体疫苗的保护机制相关指标仍是挑战，不过对 EtpA 抗原结构 - 功能关系的深入理解有助于开发相关检测方法，明确其作为保护性亚单位抗原的作用，并确定保护相关指标，为 ETEC 疫苗开发提供新方向。