商业PRRSV减毒疫苗作为三价活疫苗载体的潜力研究：双荧光标记重组病毒的构建与免疫原性分析

为解决猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)免疫抑制导致的继发感染问题，研究人员以HP-PRRSV减毒疫苗株GD为载体，通过反向遗传学技术构建了同时表达EGFP和mCherry的双标记重组病毒rPRRSV-mCherry-EGFP。该病毒在MARC-145细胞中连续传代10代保持稳定，并能诱导仔猪产生针对PRRSV-N、EGFP和mCherry的特异性抗体，证实了PRRSV减毒疫苗作为三价疫苗载体的潜力，为多病原交叉保护疫苗设计提供了重要依据。

　　

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是全球养猪业面临的重大疫病，其病原PRRSV具有典型的免疫抑制特性，易导致其他病原的继发感染。目前商业化的PRRSV减毒活疫苗(MLV)虽能提供部分保护，但无法解决多病原混合感染的难题。如何利用现有疫苗平台开发兼具PRRSV和其他重要病原保护效力的多价疫苗，成为当前研究的焦点。

中国农业科学院兰州兽医研究所的研究团队创新性地利用HP-PRRSV MLV疫苗株GD的反向遗传系统，在病毒基因组ORF1-ORF2和ORF7-3'UTR两个非重叠区域分别插入mCherry和EGFP报告基因，成功构建了能同时表达双荧光蛋白的重组病毒rPRRSV-mCherry-EGFP。该研究证实了商业PRRSV减毒疫苗作为三价活疫苗载体的可行性，相关成果发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》。

研究采用的主要技术包括：基于细菌人工染色体(BAC)系统的PRRSV反向遗传操作、双荧光蛋白标记的病毒拯救与传代稳定性评估、流式细胞术检测病毒感染动态、仔猪免疫实验及抗体应答分析等。

【结果部分】

1. 构建与鉴定表达EGFP的重组PRRSV
   在ORF7-3'UTR区间插入含TRS6的EGFP表达盒， rescued virus rGD-EGFP在MARC-145细胞中呈现典型绿色荧光，Western blot检测到PRRSV-N和EGFP蛋白条带，生长曲线显示其复制能力与亲本病毒相当。

2. 构建与鉴定表达mCherry的重组PRRSV
   在ORF1-ORF2区间插入含TRS6的mCherry表达盒，重组病毒rGD-mCherry可稳定表达红色荧光蛋白，传代后仍保持完整基因结构。

3. 双标记病毒的构建与特性分析
   rPRRSV-mCherry-EGFP能同时表达红绿双色荧光，活细胞成像显示荧光信号随病毒复制从核周向胞质扩散。流式分析证实48 hpi时双阳性细胞比例达51.4%。

4. 传代稳定性验证
   连续传代10代后，RT-PCR仍可检测到完整的EGFP和mCherry基因序列，Western blot持续检测到双外源蛋白表达，病毒滴度保持稳定。

5. 抗病毒药物筛选平台应用
   以核糖类似物利巴韦林验证发现，药物浓度与荧光强度呈负相关，证实该重组病毒可作为高通量药物筛选的直观工具。

6. 仔猪免疫原性评价
   接种重组病毒的仔猪未出现发热症状，ELISA检测显示PRRSV-N抗体阳性率100%，Western blot证实血清能识别纯化的EGFP/mCherry蛋白及病毒感染细胞中的靶蛋白。

【结论与意义】
该研究首次证实商业PRRSV减毒疫苗可同时容纳两个外源基因（总长<1500 bp）并保持稳定表达，突破了传统单价疫苗的局限。插入位点选择ORF1-ORF2和ORF7-3'UTR这两个非重叠区域是关键创新，避免了转录干扰。研究为开发能同时预防PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)的三价疫苗提供了直接证据，提出的"一苗防三病"策略具有重要临床应用价值。

未来研究可进一步探索：1）用真实病原抗原基因替代报告基因后的免疫保护效果；2）插入细胞因子基因（如IL-15）的免疫增强作用；3）外源基因长度上限的精确界定。该载体系统还可拓展至其他动脉炎病毒疫苗开发，为动物疫苗设计提供了新思路。