患者来源的恶性疟原虫和间日疟原虫临床分离株RNA甲基化组特征揭示疟疾发病新机制

本研究针对疟原虫RNA表观转录组调控机制不清的问题，通过纳米孔直接RNA测序技术首次解析了伴肝功能异常的恶性疟原虫(P. falciparum)和间日疟原虫(P. vivax)临床分离株的单碱基分辨率m6A和m5C甲基化特征。研究发现两种疟原虫在编码区、天然反义转录本(NATs)和基因间区存在物种特异性甲基化模式，并鉴定出线粒体基因、虫体表面蛋白等重要功能基因的双重修饰事件，为阐明疟原虫转录后调控网络提供了新视角。

　　

疟疾仍是全球重大公共卫生威胁，2023年WHO报告显示全球病例达2.63亿例。恶性疟原虫(P. falciparum)和间日疟原虫(P. vivax)是主要致病虫种，其复杂的基因调控机制特别是转录后修饰在宿主适应中起关键作用。尽管已有研究揭示了DNA甲基化等表观遗传机制，但RNA修饰如N⁶-甲基腺苷(m⁶A)和5-甲基胞嘧啶(m⁵C)在临床分离株中的全景特征仍属空白。

印度理工学院等机构的研究团队首次采用纳米孔直接RNA测序技术，对伴肝功能异常的恶性疟原虫(PFC)和间日疟原虫(PVC)临床分离株进行全转录组分析。研究发现两种疟原虫超过50%的基因存在表达，包含大量新异构体和基因间转录本。m⁶A和m⁵C修饰在编码区显著富集，线粒体细胞色素c氧化酶亚基等关键代谢基因呈现双重修饰。这些发现为理解疟原虫在宿主体内的适应性调控提供了新见解，相关成果发表于《Malaria Journal》。

研究采用纳米孔直接RNA测序获取全长转录本，通过FLAIR进行转录组重建，SQANTI3分类转录本结构，CHEUI和m6Anet检测甲基化修饰。来自印度比卡纳尔医学院的临床样本经PCR验证为单一虫种感染，符合WHO严重疟疾标准。

转录组重建与可变剪接事件
分析显示PFC和PVC分别表达3258和3130个转录本，包含1981和1269个完全剪接匹配(FSM)异构体。值得注意的是，PF3D7_0210100核糖体蛋白基因在PFC中检测到新型剪接变体，长度缩短50%。两种虫种均以3'/5'端可变剪接为主导事件，PFC中发现6个染色体内融合转录本，与培养株研究的染色体间融合形成对比。

甲基化特征分布
m⁵C和m⁶A在PFC中分别鉴定出588和785个高置信度修饰转录本，PVC中为328和340个。线粒体基因PVAD80_MIT0002.1(细胞色素c氧化酶亚基I)和PVAD80_MIT0001.1(亚基III)显示双重修饰，可能影响电子传递链功能。早期转录膜蛋白ETRAMP2(PVX_090230/PF3D7_0202500)在两种虫种中均检测到m⁶A修饰(概率0.999)，提示其在严重疟疾中的特殊作用。

功能富集分析
甲基化基因显著富集于核糖体生物发生(pfa03010/pvx03010通路)和糖酵解过程(GO:0006096)。PFC中GO:0036396(m⁶A甲基转移酶复合体)的富集提示自调控机制。PVC中细胞骨架组织(GO:0007010)相关基因修饰可能影响虫体侵袭策略。

讨论与意义
该研究首次绘制了临床疟原虫分离株的全景RNA甲基化图谱，揭示m⁶A和m⁵C协同调控模式。与培养株数据相比，临床样本仅5个核糖体RNA基因修饰保守，凸显体内外研究的差异。虫体表面蛋白如Pvs25(PVX_111175)和半胱氨酸蛋白酶vivapain-2(PVX_091405)的修饰可能影响其作为药物靶点的有效性。研究建立的纳米孔测序方法为低丰度临床样本的表观转录组研究提供了新范式，为开发针对RNA修饰环节的抗疟策略奠定基础。