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鹅星状病毒（GAstV）引发内脏痛风，给鹅产业带来严重损失，且尚无有效疫苗。研究人员构建鸭肠炎病毒（DEV）载体表达 GAstV 的 ORF2 基因。结果显示该载体可表达 Cap 蛋白并形成病毒样颗粒（VLPs），为双价疫苗开发奠定基础。
近年来，鹅养殖产业在我国发展迅速，然而，一种名为鹅星状病毒（GAstV）的病原体却如同一颗 “定时炸弹”，严重威胁着鹅群的健康。自 2015 年起，GAstV 感染在我国沿海地区的鹅群中频繁爆发，随后迅速蔓延至内陆省份。感染后的鹅会出现关节和内脏痛风症状，死亡率居高不下，这使得鹅养殖企业和农户遭受了巨大的经济损失。
目前，针对 GAstV - 1，市面上还没有安全有效的商业疫苗。传统的疫苗研发思路，如开发灭活病毒疫苗、减毒病毒疫苗、亚单位疫苗和 mRNA 疫苗等，都面临着重重困难。例如，由于缺乏有效的体外培养系统，GAstV 的减毒或灭活疫苗研发进展缓慢；亚单位疫苗免疫雏鹅后产生抗体的时间较长，而雏鹅在 5 - 15 日龄时对疾病极为敏感，难以评估其保护效果；mRNA 疫苗对于水禽疫苗制备来说成本过高。在这样的背景下，寻找一种新的疫苗研发途径迫在眉睫。
浙江省农业科学院畜牧兽医研究所的研究人员勇挑重担，开展了一项极具意义的研究。他们以鸭肠炎病毒（DEV）为载体，尝试表达 GAstV 的开放阅读框 2（ORF2）基因，期望构建出一种能够同时预防 DEV 和 GAstV 感染的双价疫苗。最终，研究取得了令人振奋的成果，证实 DEV 是一种良好的 GAstV ORF2 基因递送载体，这一发现为双价疫苗的开发提供了坚实的基础，有望解决 GAstV 感染这一难题，拯救遭受重创的鹅养殖产业。该研究成果发表在《BMC Veterinary Research》杂志上。
研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在基因操作方面，利用 Red E/T 两步重组技术，将 GAstV ORF2 表达框插入到 DEV 基因组的 US7 和 US8 基因间隔区。为验证基因表达和蛋白情况，使用了蛋白质印迹（Western blotting）分析 Cap 蛋白的表达；通过间接免疫荧光试验（IFA）观察蛋白细胞定位并验证 ORF2 表达；借助免疫金电子显微镜（IEM）检测病毒样颗粒（VLPs）的形成 。
下面来看具体的研究结果：
- 氨基酸序列保守性分析：通过 pBLAST 对 GAstV Cap 序列进行比对，发现 2016 - 2023 年我国 12 个省份 GAstV - 1 病样中 Cap 蛋白的氨基酸序列高度保守，同源性在 98.72% - 100% 之间。这一结果表明 GAstV Cap 蛋白在不同地区的病毒株中较为稳定，为基于该蛋白开发疫苗提供了有利条件。
- BAC 突变体鉴定：运用限制性片段长度多态性（RFLP）方法对突变的 BAC 克隆进行鉴定。对突变 BAC 克隆及中间产物的 DNA 进行 BamH I 酶切，电泳检查结果显示，酶切图谱与基于参考 DEV 疫苗株基因组的预测图谱相符，且 PCR 产物的大小和序列也与预期一致，证实了外源基因成功插入到 DEV 基因组的预期位点。
- 重组病毒拯救：将制备好的突变 BAC DNA 通过磷酸钙沉淀法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）。转染 48 小时后，可见荧光斑块，表明重组病毒成功拯救，收集 80% 以上细胞出现荧光时的细胞，获得重组病毒 rDEV - GAstV ORF2。
- 噬菌斑大小测量：对 rDEV - GAstV ORF2 病毒的噬菌斑大小进行检测，发现其比亲本 rDEV - EF1 病毒的噬菌斑显著小 16.44%（P = 0.03） 。这一差异可能与外源基因的插入对病毒的生长特性产生影响有关。
- 多步生长动力学分析：比较 rDEV - GAstV ORF2 和 rDEV - EF1 的多步生长动力学，结果显示重组病毒 rDEV - GAstV ORF2（包括细胞内和细胞外）的生长特征与亲本 rDEV - EF1 几乎相同，且病毒滴度在感染后 12 - 60 小时稳步上升。这说明外源基因的插入未对病毒的整体生长趋势产生明显不良影响。
- Cap 蛋白分析：利用蛋白质印迹和 IFA 检测发现，在 rDEV - GAstV ORF2 感染的细胞和培养上清中存在约 82kDa 的特异性条带，而 rDEV - EF1 感染的细胞中不存在，证实 GAstV Cap 蛋白在 CEFs 中成功表达。
- 蛋白定位观察：通过 IFA 检测 GAstV Cap 在 CEFs 中的定位，结果表明该蛋白主要定位于细胞质中。这为进一步了解 Cap 蛋白的功能和病毒的感染机制提供了重要线索。
- 免疫电镜分析：免疫电镜分析显示，在感染重组病毒的 CEFs 中，GAstV Cap 能够形成 VLPs，且 VLPs 呈晶格状排列，周围有 ORF2 编码的蛋白质。这一结果直接证明了利用 DEV 载体成功表达了具有组装成 VLPs 能力的 Cap 蛋白。
综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。一方面，首次证实了 DEV 可作为 GAstV ORF2 基因的有效载体，在细胞内成功表达 Cap 蛋白并形成 VLPs。VLPs 具有良好的安全性和稳定性，能有效模拟亲本病毒特征，激发辅助性 T 细胞活化，即便在较低剂量下也能展现出优异的免疫原性，这对于诱导机体产生针对 GAstV 的高水平中和抗体至关重要。另一方面，研究成果为开发同时预防 DEV 和 GAstV - 1 感染的双价疫苗奠定了坚实基础，有望解决长期以来 GAstV 感染无有效疫苗的困境，推动鹅养殖产业的健康发展。不过，目前该重组病毒作为候选疫苗在鹅体内的免疫效果和安全性仍需进一步研究评估。但无论如何，此项研究为鹅星状病毒疫苗的研发开辟了新方向，具有极高的理论价值和应用潜力，值得相关领域科研人员持续关注和深入探索。
