靶向猪Y染色体精子质膜表位的单链可变区抗体(scFv)的构建及其在性别分选中的应用

本研究针对猪精液性别分选技术成本高、损伤大的问题，开发了特异性靶向Y染色体精子(Y-sperm)质膜表位的单链可变区抗体(scFv)。通过杂交瘤技术获得4D1-E8单克隆抗体(mAb)，进而构建795bp scFv基因并在大肠杆菌中表达。H4:L4 scFv对Y-sperm特异性达100%，与X-sperm交叉反应仅4.14%，显著优于亲本mAb(15.5%)。该研究为猪性别控制提供了新型免疫学工具，发表于《Scientific Reports》。

　　

在畜牧业生产中，控制后代性别具有重要经济价值。目前流式细胞分选技术虽能准确分离X/Y染色体精子，但存在设备昂贵（每台超200万元）、处理效率低（猪精液每小时仅处理500万精子）、精子存活率下降等技术瓶颈。更棘手的是，猪子宫特殊的解剖结构使低剂量精液难以实现有效受孕。传统免疫分选法因抗体特异性不足（交叉反应达15%以上）和Fc段非特异性结合等问题，始终未能突破临床应用瓶颈。

针对这些技术难题，泰国清迈大学动物与水产科学系家畜创新与生物循环实验室联合华南农业大学食品质量安全重点实验室的研究团队，创新性地将重组抗体技术引入猪精液性别分选领域。研究团队通过构建靶向Y精子质膜表位的单链可变区抗体(scFv)，成功在《Scientific Reports》发表突破性成果，为猪性别控制提供了新方案。

研究采用三步技术路线：首先通过流式分选获得纯度>90%的Y-sperm免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术筛选出特异性最强的4D1-E8单克隆抗体（对Y-sperm结合活性达X-sperm的7倍）；随后通过RT-PCR扩增VH(450bp)和VL(300bp)基因片段，构建795bp scFv基因并克隆至pET22b载体；最后在E. coli BL21(DE3)中表达获得25kDa可溶性H4:L4 scFv抗体。关键技术包括流式细胞分选、杂交瘤筛选、scFv基因组装、原核表达系统优化以及免疫荧光定位等。

在单克隆抗体生产部分，研究显示4D1-E8克隆对Y-sperm的OD_450nm值达1.152±0.07，显著高于X-sperm的0.152±0.01。通过12%SDS-PAGE验证获得完整IgG1抗体，为后续scFv构建奠定基础。重组抗体生产环节，基因测序证实scFv正确组装（图2b），Ni-NTA纯化获得高纯度蛋白（图4a）。Western blot显示目标条带位于28kDa处（图4b），与理论分子量相符。

抗体特异性验证获得突破性发现：间接ELISA显示H4:L4 scFv对Y-sperm交叉反应达100%，而对X-sperm仅4.14%，显著优于亲本mAb的15.5%（表3）。但值得注意的是，该抗体对水牛精液仍有38.8%交叉反应（表4）。流式双荧光染色证实，scFv能特异性标记93.7±3.1%的Y-sperm，而X-sperm标记率仅3.9±1.8%（表5）。免疫荧光定位显示，scFv特异性结合Y-sperm顶体后区质膜（图7a），与传统精液中的随机标记模式形成鲜明对比（图7c）。

讨论部分指出，这是首例针对猪Y-sperm的scFv抗体研究。相较于传统mAb，scFv分子量更小（25kDa vs. 150kDa）、不含Fc段，有效避免了精浆蛋白的非特异性结合。研究团队特别强调，虽然scFv对其它畜种精液存在交叉反应，但结合比例严格遵循各物种天然X/Y精子比率（如公牛27.4% vs 2.5%），提示其识别的是进化保守的雄性特异性表位。后续研究（Thongkham et al., 2025）已证实该scFv结合磁珠可建立高效分选体系。

该研究的创新价值体现在三方面：首次证明scFv在猪精子性别分选的适用性；建立从杂交瘤到scFv的完整技术路线；为开发低成本（预估成本降低60%）、低损伤的免疫分选试剂奠定基础。正如作者所述，这项成果标志着继人工授精和胚胎移植之后，家畜繁殖技术可能迎来第三次革命性突破。未来通过人源化改造和磁珠系统优化，该技术有望推动性别控制技术在养猪业的规模化应用。