综述：单分子灵敏度核酸与蛋白质检测分析技术

这篇综述系统梳理了具有单分子检测灵敏度的核酸与蛋白质分析技术（如dPCR、NGS、SiMREPS等），对比了传统扩增技术（PCR/ELISA）的局限性，重点探讨了其在液体活检中的应用潜力。文章从技术原理、检测限（LoD）、多路复用能力等维度，剖析了数字PCR（dPCR）、单分子阵列（Simoa）、纳米孔测序等前沿方法的优势与挑战，为精准医疗时代的高灵敏度分子诊断提供了技术路线图。

　　

单分子检测技术的革命性突破
分子诊断领域正经历从群体水平检测向单分子精度的范式转变。传统技术如聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）虽广泛应用，但其依赖靶标或信号分子扩增的特性，在检测灵敏度（如0.1% VAF）、特异性及多重检测能力方面存在瓶颈。

分区扩增策略的进化
数字PCR（dPCR）通过微滴或微孔阵列将样本分割为数万反应单元，基于泊松分布实现绝对定量，较qPCR提升10倍灵敏度。进阶技术如磁珠乳扩增（BEAMing）和超滚环扩增（SuperRCA）通过多级信号放大，分别将ctDNA检测限推至0.01%和0.001%。而下一代测序（NGS）虽通量高，但1%的原始检测限需依赖分子条形码（如Safer-SeqS）优化。

信号放大与真实单分子检测
单分子阵列（Simoa）通过β-半乳糖苷酶介导的荧光信号扩增，将蛋白检测灵敏度提升至飞摩尔级。更革命性的真实单分子技术如单分子动力学指纹（SiMREPS）利用探针-靶标动态结合特征，实现0.0001%突变频率区分；Argonaute荧光原位杂交（Ago-FISH）则借助预载探针加速检测过程。

多维技术比较与应用前景
纳米孔测序和单分子实时测序（SMRT）突破读长限制，但错误率较高。表面增强拉曼（SERS）和单分子免疫共沉淀（SiMPull）分别展示多蛋白分析和蛋白互作研究的潜力。这些技术在液体活检中面临临床转化挑战，需平衡检测速度（如动态FRET-FISH提速60倍）、成本与自动化程度。

未来发展方向
消除扩增步骤、开发便携设备（如<10万美元显微镜）和建立标准化流程是技术落地的关键。随着单分子计数从概念走向临床，其将在癌症早筛、神经退行性疾病监测和感染病诊断中重塑分子诊断格局。