突破FFPE组织单细胞转录组学瓶颈：低温酶解核分离技术snCED-seq实现高保真单核RNA测序

为解决FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织单核RNA测序中RNA交联导致的核分离难题，研究人员开发了低温酶解核分离技术（CED），结合snRandom-seq平台建立snCED-seq方法。该技术实现核产量提升10倍、RNA降解减少，在阿尔茨海默病模型中发现星形胶质细胞亚群等细胞异质性，并能从50μm人类肺组织切片中识别主要细胞类型。该研究为临床样本多组学分析提供了可靠技术平台。

　　

在生物医学研究领域，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本堪称一座巨大的"分子档案馆"，保存着无数珍贵的临床病例资源。然而这些样本中的RNA分子因甲醛交联作用而"锁死"，使得单核RNA测序（snRNA-seq）技术难以施展拳脚。传统的高温酶解法（HED）虽能"撬开"组织，却常常导致RNA降解和核膜损伤，而机械匀浆法则面临组织碎片污染、核产量低的困境。如何从这些"分子化石"中高质量地提取细胞核，成为解锁临床样本转录组信息的重大挑战。

东南大学等机构的研究团队在《Nature Communications》发表的研究中，开发出革命性的低温酶解核分离技术（CED），结合snRandom-seq平台建立snCED-seq方法。研究人员通过系统优化解离温度、试剂和时间等关键参数，使用十二烷基肌氨酸钠（sarkosyl）替代传统去垢剂，在4°C条件下实现FFPE组织温和解离。该方法无需超速离心或过滤步骤，核产量达传统方法的10倍（每克海马组织获得>10⁵个核），RNA完整性数（RIN）显著优于高温处理组。

关键技术包括：1）建立CED核分离流程，比较其与机械匀浆法在冷冻、PFA固定和FFPE小鼠脑组织的性能差异；2）采用snRandom-seq平台进行全长转录本捕获；3）分析5xFAD阿尔茨海默病（AD）模型小鼠6万余个海马单核转录组；4）验证50μm人类FFPE肺组织切片的适用性。

"核质保真度验证"部分显示，CED法获得的核形态完整、分散性好，cDNA主峰>1200bp（高温组仅800bp）。测序数据显示，FFPE(4°C)组每个核平均检测2013个基因和8759个UMI（唯一分子标识符），显著高于高温组（1347个基因/4996个UMI），且线粒体/核糖体RNA污染近乎为零。与冷冻样本的基因表达相关性达0.99，而机械匀浆法FFPE(MHD)组有4960个基因显著低表达。

"AD小鼠细胞异质性分析"部分发现，snCED-seq成功鉴定出22个细胞簇，包括9个兴奋性神经元（ExN）、4个GABA能神经元和9个非神经元群体。特别值得注意的是：1）发现疾病相关小胶质细胞（DAM）亚群Micro2/3高表达Tmem163、Skap1等AD相关基因；2）星形胶质细胞亚群Ast2/4（DAA）特异性高表达Kcnip4、Gfap等基因；3）少突胶质细胞亚群Oligo2/5（DAO）与DAA共享疾病易感基因表达模式。血管相关细胞（内皮细胞和室管膜细胞）也显示出显著的转录扰动。

"人类FFPE微样本验证"部分证明，从单张50μm肺组织切片可获得15万个核，鉴定出肺泡上皮细胞（AT1/2）、免疫细胞等10个主要群体，细胞比例与冷冻样本高度一致。

这项研究的意义在于：1）建立首个适用于FFPE组织的低温核分离技术标准，解决RNA交联和降解难题；2）揭示AD中胶质细胞-血管单元的协同病变机制，发现Kcnip4等跨细胞类型调控枢纽；3）为利用临床病理档案开展精准医学研究提供技术支撑。研究者特别指出，CED法获得的核可耐受干冰保存，这一特性打破了核样本必须新鲜处理的传统认知。该技术有望推动FFPE样本库在疾病机制研究、生物标志物发现等领域的广泛应用，为解密人类疾病分子档案提供关键工具。