mRNA 疫苗：对抗环形泰勒虫病的新希望

本文利用免疫信息学方法，从环形泰勒虫（Theileria annulata）蛋白质组中筛选抗原蛋白，设计新型 mRNA 疫苗。经多方面分析，该疫苗稳定、无毒、无致敏性，能有效激发体液和细胞免疫反应，为防控泰勒虫病提供新思路。

　　

研究背景

牛泰勒虫病是热带和亚热带地区畜牧业面临的重大挑战，由蜱传播，对全球畜牧业造成严重经济损失。环形泰勒虫（Theileria annulata）是世界范围内泰勒虫病的主要病原体，会导致动物发热、贫血和黄疸等症状。

目前，热带泰勒虫病的防控主要依赖活减毒疫苗和药物治疗。然而，活减毒疫苗存在诸多问题，如可能将活疫苗生物引入非流行地区、传播感染、产生带虫动物等。DNA 疫苗和亚单位疫苗也有各自的局限性，前者存在插入诱变风险，后者激发免疫反应能力有限。

mRNA 疫苗在应对 DNA 和肽基疫苗的安全性和有效性问题上表现出优势，可快速大规模生产，能携带多种抗原，诱导体液和细胞免疫反应，是预防和控制牛泰勒虫病的有前景的策略。免疫信息学在疫苗设计中起着关键作用，可预测合适的抗原、表位等，降低疫苗开发的时间和成本。本研究旨在利用免疫信息学设计一种针对环形泰勒虫的创新多价 mRNA 疫苗。

材料和方法

1. 蛋白质序列检索：从 NCBI 数据库获取环形泰勒虫的氨基酸序列，用 SignalP 5.0 筛选含信号肽的蛋白质，用跨膜隐马尔可夫模型（MHMM）鉴定跨膜结构域蛋白，利用 TargetP 算法排除定位于线粒体或顶质体的蛋白。
2. 免疫细胞表位预测：使用 ABCpred 在线工具预测线性 B 细胞表位（LBL），设置肽长度为 16 个氨基酸，特异性 80%，重叠筛选和阈值 0.7。用 IEDB 主要组织相容性复合体 I 类（MHC I）网络服务器预测细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）表位，选择 9 个蛋白以 FASTA 格式输入，使用 ANN 4.0 设置预测 9 聚体 CTL 表位，分析采用完整的牛 BoLA 参考集。
3. 牛同源性分析：将选定免疫细胞表位序列与 NCBI 数据库中牛蛋白质组（TaxID: 9913）进行 BLASTp 分析，E 值超过 0.05 的肽被视为与牛肽可能非同源。
4. 表位生物学特性评估：利用 VaxiJen 网络服务器、AllerTop V.2.0 网络服务器和 ToxinPred V.2.0 网络服务器分别评估表位的抗原性、致敏性和毒性，选择高抗原性、无毒且无致敏性的表位进一步研究。
5. CTL 表位与 MHC I 的分子对接：从 UniProt 数据库下载牛 MHC-I 等位基因序列，因无 3D 晶体结构，通过 Swiss - Model 服务器同源建模并经蛋白质结构精修服务器优化，模板为 HLA - B*07:02（P01889）。用 ClusPro 2.0 服务器进行分子对接，LigPlot⁺可视化表位与 MHC 等位基因间的相互作用。
6. 疫苗构建体设计：选择高抗原性、无致敏性和毒性且与牛蛋白质组不相似的表位作为疫苗开发的候选表位。mRNA 疫苗构建体按特定顺序设计，包括适配帽结构（m7GCap）、5’非翻译区（5’ UTR）、Kozak 序列，编码区起始为信号肽（tPA），通过 EAAAK 接头连接佐剂成分，本研究中 RpfE 被确定为合适佐剂。
7. 疫苗配方的抗原性、致敏性、毒性和理化特性预测：用 VaxiJen v2.0 和 AllerTOP 分别预测 mRNA 疫苗构建体的抗原性和致敏性，ToxinPred 服务器预测毒性，ProtParam 在线网络服务器预测疫苗的一系列理化特性。
8. 计算机免疫模拟：利用 C - ImmSim 服务器预测 mRNA 疫苗引发的免疫反应，按照既定疫苗给药方案，在 4 周内给予 3 剂 1000 疫苗单位，默认参数设置，注射时间点为 1、84 和 168 小时。
9. 所需疫苗的密码子优化：使用 GenScript 的 GenSmart 工具优化密码子以提高 mRNA 在牛细胞疫苗中的表达，通过稀有密码子分析评估修饰序列质量，用密码子适应指数（CAI）评估翻译效率。
10. 设计的 mRNA 疫苗二级结构预测：用 Vienna RNA Package 2.0 的 RNAfold 工具评估 mRNA 疫苗的二级结构。
11. 疫苗二级和三级结构的预测与验证：用 PSIPRED 服务器预测疫苗的二级结构，Robetta 服务器预测肽序列的 3D 结构，ProSA - web、PROCHECK 和 ERRAT 服务器评估模型质量。
12. 构象 B 细胞表位预测：使用 ElliPro 在线服务器预测构象 B 细胞表位。
13. 疫苗与 Toll 样受体（TLRs）分子相互作用研究：用 ClusPro 服务器评估目标 mRNA 疫苗与 TLR 2、3、4 和 9 的潜在相互作用，对缺乏晶体结构的蛋白通过 Swiss - Model 服务器生成可靠模型并优化，用 PIPER 对接算法进行对接分析。
14. 分子动力学模拟：使用 iMODS 服务器对牛 TLR - 2、TLR - 3、TLR - 4 和 TLR - 9 与疫苗形成的复合物进行分子动力学模拟，选择结合能最有利的复合物分析原子和分子的稳定性及运动。

研究结果

1. 蛋白质序列检索结果：从 8887 个蛋白序列中，鉴定出 408 个含潜在信号肽的蛋白，其中 31 个含跨膜结构域，最终筛选出 9 个蛋白序列（XP954696.1、XP955218.1 等）进行进一步研究。
2. B 细胞表位预测与评估结果：共鉴定出 16 个高抗原性（VaxiJen 评分超 0.7）、无致敏性和毒性的 B 细胞表位。
3. CTL 表位预测与评估结果：确定了 28 个满足严格筛选标准的 CTL 表位，包括高抗原性、无致敏性、无毒性且与人类蛋白无显著同源性。
4. CTL 表位与牛 MHC 等位基因的分子对接结果：28 个 CTL 表位建模后与相应牛 MHC - I 等位基因对接，FLILINLNI、TLWAYKVWL 等 5 个表位与牛 MHC - I 等位基因结合亲和力最高，结合能分别为 - 1047.4、 - 992.4 等 kcal/mol。
5. 疫苗构建体设计结果：精心选择 28 个 CTL 表位和 16 个 B 细胞表位，用特定肽接头连接，构建的 mRNA 疫苗结构从 N 端到 C 端依次为 5’ m7GCap、5’UTR 等多种成分。
6. 疫苗构建体的生物学和理化性质评估结果：疫苗构建体抗原性得分 1.0045，非致敏性、无毒，分子量 75693.85 Da，稳定性好，半衰期在不同生物系统中各异，如在哺乳动物网织红细胞体外约 4.4 小时等。
7. 计算机免疫反应模拟结果：模拟显示疫苗有效激活先天免疫系统，引发强大的适应性免疫反应，刺激 B 细胞产生高水平 IgM，T 辅助细胞和 CTL 显著响应，巨噬细胞活性增强，诱导关键细胞因子（如 IFN - γ 和 IL - 2）水平升高。
8. mRNA 构建体的密码子优化结果：优化后的疫苗密码子适应指数（CAI）为 0.71，编码序列（CDS）长度 2049 个核苷酸，平均 GC 含量 50.37%，适合在牛细胞中高效表达。
9. mRNA 疫苗二级结构预测结果：mRNA 序列二级结构的最小自由能（MFE）为 - 669.79 kcal/mol，二级质心结构自由能为 - 539.77 kcal/mol，表明疫苗构建体在制造过程中保持稳定。
10. 翻译构建体的二级和三级结构评估结果：RNA 结构分析显示结构组成为 17%α - 螺旋、32%β - 链和 33% 无规卷曲，3D 结构模型质量良好，Ramachandran 图显示 90% 的残基位于最有利区域。
11. 构象 B 细胞表位预测结果：分析揭示 7 个非连续 B 细胞表位，预测得分 0.505 - 0.846，对诱导体液免疫和促进抗体产生至关重要。
12. 与 TLR 的相互作用和疫苗设计结果：分子动力学模拟表明疫苗 - 受体复合物变形指数低、刚度大、稳定性高，具有强分子间相互作用和坚固结构框架，有利于有效免疫相互作用。

讨论

传统兽医疫苗开发方法有局限性，一些疾病难以用常规方法防控。亚单位疫苗需佐剂且成本高，重组载体和 DNA 疫苗存在疗效和生产问题。众多抗原靶点用于构建抗泰勒虫亚单位疫苗，部分能提供部分保护。DNA 疫苗可引发细胞介导免疫反应，但在保护效果上存在差异。

mRNA 疫苗在对抗多种病毒感染中展现出疗效，具有生产简便、开发迅速等优势，免疫信息学助力其发展，成为预防微生物感染的理想选择。疫苗开发需激活 B 细胞和 T 细胞以诱导持久免疫，本研究设计的 mRNA 疫苗针对环形泰勒虫表面蛋白，经多方面分析验证，具备有效刺激免疫反应的潜力。但研究存在局限性，如 MHC 等位基因结构获取受限等，未来需在实验室或动物模型中进一步验证。

结论

本研究设计的多表位 mRNA 疫苗有望成为对抗环形泰勒虫感染的有效策略，但需进一步的体外和体内研究来验证其安全性和有效性，为牛泰勒虫病的防控提供了新方向，对兽医医学和畜牧健康管理具有潜在重要意义。