综述：通过差示扫描量热法对冷冻培养基的热物理特性表征优化人卵巢组织冷冻保存的冻融方案

这篇综述推荐通过差示扫描量热法（DSC）对含1.5M DMSO和0.1M蔗糖的Leibovitz L-15培养基进行热力学特性分析（Tg'=?120.49°C，Tm=?4.11°C），据此优化出分阶段冻融方案（冷冻程序：5min@4°C→1°C/min至?7°C→60°C/min至?32°C；解冻程序：3.5min@?20°C→2min@37°C），证实该方案能维持卵巢组织活性并支持卵泡发生（folliculogenesis）。

　　

引言

随着癌症诊疗技术的进步，患者五年生存率显著提升，但烷化剂等抗癌治疗具有性腺毒性（gonadotoxicity），使得生育力保存（fertility preservation）成为必要措施。对于青春期前女童及部分癌症患者，卵巢组织冷冻保存（OTC）是目前唯一可行的生育力保存方案。尽管全球已有200例通过OTC成功分娩的案例，但现有冻融方案存在显著异质性，缺乏标准化依据。

冷冻培养基的热物理特性

研究采用差示扫描量热法（DSC）对三种常用冷冻培养基进行热力学表征：

1. 溶液1（Leibovitz L-15+1.5M DMSO+0.1M蔗糖+4mg/mL HSA）：T_g'=?120.49±0.41°C，T_m=?4.11±0.49°C，结晶焓ΔH=?184.80J/g，冰晶形成比例Q_max=55.43%。
2. 溶液2/3（含1,2-丙二醇或PBS）热力学参数相近，但溶液1因临床活产率最高被选为优化基础。

冷冻方案优化

基于DSC数据设计的程序化冷冻曲线（Nano-Digitcool设备）包含关键步骤：

1. 预平衡：4°C维持5分钟促进CPA渗透；
2. 梯度降温：1°C/min至?7°C（低于T_m以避免重结晶）；
3. 晶核诱导：60°C/min骤冷至?32°C，ΔT仅1°C（最小化热冲击）；
4. 冰晶生长：0.3°C/min至?40°C；
5. 深度冷冻：10°C/min至?140°C后投入液氮。

解冻方案创新

针对玻璃态（44.6%培养基成分）易受机械损伤的特性，提出两阶段解冻：

1. 慢速阶段：?20°C冷室中3.5分钟（22.88°C/min）平稳跨越T_g'；
2. 快速阶段：37°C水浴2分钟迅速通过T_m防止再结晶。

生物学验证

使用良性卵巢囊肿切除术获取的皮质组织（n=3，27.7±2.8岁）验证方案：

• 组织学：冻融组与新鲜组卵泡形态、分布无差异（原始卵泡占比14.20% vs 16.85%，p=0.513）；
• 功能评估：7天器官型培养中，冻融组仍保持GDF9表达（83.41%→80.33%），且初级卵泡比例从22.45%增至47.65%（p=0.052），证实卵泡激活能力；
• 凋亡/增殖：Ki67阳性率从49.84%升至81.85%（p<0.001），但凋亡（CC3+）同步增加（10.79%→67.91%），提示需优化培养条件。

讨论与展望

本研究首次通过DSC量化冷冻培养基热力学参数指导OTC方案设计，解决了传统经验性方案的盲目性。尽管冻融组织在体外模型中表现良好，但需进一步开展异种移植（xenotransplantation）验证长期功能，并探索多组学手段解析低温损伤机制。该方案采用临床常规设备（如程序冷冻仪），便于转化应用，有望提升女性生育力保存成功率。