编辑推荐：
在真菌酪氨酸酶研究中，米根霉（Amylomyces rouxii）产生的胞外酪氨酸酶纯化困难且活性受限。研究人员通过沉默米根霉的蛋白酶基因，开展对其胞外酪氨酸酶的研究。结果显示，突变株 A412 - 3 的酶活性显著提升且部分纯化成功，这为相关工业应用提供了新方向。
酪氨酸酶（Tyrosinase，EC 1.14.18.1），又称多酚氧化酶（polyphenoloxidase），在生物界中广泛存在，从哺乳动物到微生物都有它的身影。在哺乳动物体内，它是黑色素合成的关键酶；在植物中，它参与氧化还原电位的调节，同时也是导致水果和蔬菜酶促褐变的 “元凶”；在丝状真菌里，它和孢子色素的生物合成以及食用菌的酶促褐变密切相关。
近年来，酪氨酸酶在食品、化妆品和制药等多个行业的应用越来越广泛。比如在食品加工中，它可利用交联特性作为食品添加剂；在生物修复领域，它能处理被酚类化合物污染的废弃物和土壤 。然而，目前商业用酪氨酸酶主要从真菌细胞中提取，获取胞内酶不仅需要破碎细胞，操作繁琐，还可能降低酶活性。而且，真菌产生的酪氨酸酶大多为胞内酶，胞外酪氨酸酶相对较少，其纯化也面临诸多难题，像米根霉产生的胞外酪氨酸酶，此前就因蛋白酶的影响，纯化工作一直未能成功。
为了攻克这些难题，来自墨西哥的研究人员对米根霉展开了深入研究。他们将研究成果发表在《Folia Microbiologica》杂志上。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是酶活性测定技术，采用改良的方法分别测定胞内和胞外酪氨酸酶的单酚酶（monophenolase）和双酚酶（diphenolase）活性；二是蛋白纯化技术，运用硫酸铵沉淀、离子交换色谱和凝胶过滤色谱等方法对胞外酪氨酸酶进行部分纯化；三是电泳和测序技术，通过 SDS - PAGE 分析蛋白纯度，利用 LC - MS/MS 对纯化后的蛋白进行测序和氨基酸序列分析。
米根霉产生的胞内和胞外酪氨酸酶活性
研究人员让米根霉在添加了酪氨酸（0.1 g/L）和五氯苯酚（PCP，12.5 mg/L）的 MN 培养基中进行浸没培养。结果发现，以对甲酚（p - cresol）为底物时，胞内和胞外单酚酶活性达到最高，分别为 180 U/mL 和 80 U/mL；以邻苯二酚（catechol）为底物时，胞外双酚酶活性最高，为 975 U/mL，而以 4 - 叔丁基邻苯二酚（TBC）为底物时，胞内双酚酶活性最高，达到 2233 U/mL 。这表明米根霉能够分泌胞外酪氨酸酶，只不过其活性比胞内酶要低。而且，米根霉的单酚酶活性低于双酚酶活性，这和其他植物、哺乳动物以及真菌中的酪氨酸酶情况一致。此外，培养 48 h 时，胞外单酚酶和双酚酶活性达到最大值。
米根霉和转化体 A412 - 3 的生长及胞外酪氨酸酶产生动力学
研究人员对米根霉及其转化体 A412 - 3 进行培养，对比两者的生长情况和胞外酪氨酸酶活性。结果显示，米根霉的生物量比转化体 A412 - 3 更高，但转化体 A412 - 3 的胞外酪氨酸酶活性却更出色，其单酚酶活性是亲本菌株的 2.14 倍，双酚酶活性是亲本菌株的 3.02 倍 。基于此，研究人员选择培养 48 h 的转化体 A412 - 3 来纯化胞外酪氨酸酶。
胞外酪氨酸酶等电点的测定
利用 Rotofor 系统测定转化体 A412 - 3 产生的胞外酪氨酸酶的等电点。分离蛋白 4 h 后收集 20 个组分进行检测，发现 3 - 7 号组分的酶活性最高，等电点（pI）在 4.5 - 5.5 之间，其中 5 号组分 pI 为 5.2 时，酪氨酸酶活性最强。这一结果和其他研究中报道的酪氨酸酶等电点范围相符。
转化体 A412 - 3 胞外酪氨酸酶的部分纯化
按照特定流程对转化体 A412 - 3 的胞外酪氨酸酶进行部分纯化。经过硫酸铵沉淀、离子交换色谱和凝胶过滤色谱等步骤后，最终获得的纯化倍数，单酚酶为 10.6 倍，双酚酶为 10.6 倍 。SDS - PAGE 分析显示，纯化后的酪氨酸酶有三条条带，分别为 40 kDa、53 kDa 和 130 kDa 。对 40 kDa 条带进行 LC - MS/MS 测序，得到 8 条与不同真菌酪氨酸酶相似的肽段，其中与双孢蘑菇（Agaricus bisporus）酪氨酸酶的匹配度最高，达到 100% 。通过序列分析，还鉴定出了真菌酪氨酸酶 CuA结合基序中的保守组氨酸残基。这进一步证实了米根霉 A412 - 3 产生的胞外酚氧化酶就是分子量约为 45 kDa 的酪氨酸酶。
综合来看，这项研究首次从被污染的废水中分离出能产生酪氨酸酶的接合菌 —— 米根霉。研究发现米根霉产生的单酚酶活性低于双酚酶活性，且成功证实其能产生分子量约 40 kDa 的胞外酪氨酸酶。更重要的是，研究人员对米根霉 A412 - 3 的酪氨酸酶进行了纯化和测序，这在接合菌酪氨酸酶研究领域尚属首次。该研究为提升米根霉酪氨酸酶的生产效率、增强其降解有毒化合物的能力提供了理论依据，也为从米根霉中提取胞外酪氨酸酶用于工业和生物技术领域开辟了新途径，具有重要的科学研究价值和实际应用潜力。
