C1ql3 与 BAI3 复合物结构解析：解锁大脑突触组织的关键密码

在大脑中，adhesion-GPCR BAI3 对突触组织至关重要，但它与配体 C1qls 的结合机制不明。研究人员解析 C1ql3-BAI3 复合物的冷冻电镜结构，发现独特结合模式。这增进了对 C1ql-BAI3 介导突触组织的理解，揭示 BAI3 在大脑中的功能。

　　大脑，这个人体最神秘的 “城堡”，藏着无数奥秘，其中突触的组织和形成机制一直是神经科学领域的研究热点。adhesion-GPCR 中的 Brain-specific Angiogenesis Inhibitor-3（BAI3）在大脑突触组织中扮演着至关重要的角色，就像一位幕后 “指挥官” 。然而，它是如何与其中一个配体 C1q-like proteins（C1qls）相互作用的，这一关键问题却如同被迷雾笼罩，始终未得到清晰解答。此前，虽然知道 C1qls 与 BAIs 的结合在突触连接中意义重大，例如 C1ql1 和 BAI3 基因缺失会严重影响小脑攀爬纤维突触形成以及副嗅核神经元与嗅球颗粒细胞间突触的形成，但具体的结合模式在结构层面上一直是个谜。而且，尽管许多哺乳动物蛋白含有与 C1qls 类似的 C1q-like 结构域，但仅有 Cerebellin-1（Cbln1）的 C1q-like 结构域与 GluD2 的 N 端结构域（NTD）形成的复合物有明确的结构解析，C1q-like 结构域与其他伙伴的结合方式是否类似仍不得而知。为了揭开这层神秘的面纱，来自斯坦福大学医学院（Stanford University School of Medicine）的研究人员开展了深入研究。
他们成功解析出 C1ql3 与 BAI3 复合物的单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）结构，分辨率高达 2.8 ?。这一成果意义非凡，它为我们深入理解 C1ql-BAI3 介导的突触组织过程提供了关键线索，也让我们对 BAI3 在大脑中的功能动态有了全新的认识。该研究成果发表在《Communications Biology》上。
在这项研究中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是蛋白质表达技术，通过将 C1ql3 构建体和小鼠 BAI3 NTD 分别克隆到特定载体中，在合适的细胞系中进行表达并纯化；二是冷冻电镜技术，将纯化后的蛋白质按比例混合，经尺寸排阻色谱法处理后制备样品，利用冷冻电镜收集数据；三是图像处理与模型构建技术，在 cryoSPARC 软件中对图像进行处理，用 UCSF Chimera 和 Coot 等工具进行模型构建和优化 。
下面来看具体的研究结果：
确定 C1ql3-BAI3 NTD 复合物结构：研究人员首先证实 BAI3 的 NTD 能与 C1ql3 的球状 C1q-like 结构域形成稳定复合物。随后，通过单颗粒冷冻电镜技术，解析出小鼠 C1ql3-BAI3 NTD 复合物的结构。在复合物核心，三个球状 C1q-like 结构域形成三聚体四级结构，结合四个 Ca²⁺离子，同时三个 BAI3 NTD 与 C1ql3 三聚体结合，形成异源六聚体。
明确 C1ql3-BAI3 相互作用界面：在 C1ql3-BAI3 的相互作用界面，一个 C1ql3 分子与 BAI3 NTD 通过 Ca²⁺介导相互作用。其中，C1ql3 的 Asp180 和 Asp232、BAI3 NTD 的 Lys66 和 Asp63 参与 Ca²⁺的配位，此外，C1ql3 的 Trp188、BAI3 的 Lys66 和 Tyr67 通过 π 堆积作用进一步稳定复合物。同时，第二个 C1q-like 结构域也与 BAI3 NTD 形成广泛相互作用。
鉴定 BAI3 NTD 的结构域类型：通过 DALI 搜索，发现 BAI3 NTD 与多种蛋白质的 CUB 结构域相似，尤其是补体激活 C1 复合物中丝氨酸蛋白酶 C1r 的 CUB 结构域。尽管氨基酸同一性较低，但二者核心 β 链有一定保守性，BAI3 NTD 还含有额外的 α 螺旋，这暗示其可能存在尚未明确的相互作用，也表明 BAI3 NTD 的 CUB 结构域可能具有信号传导和 / 或调节功能。
探究 BAI1、BAI2 和 BAI3 与 C1qls 结合差异的原因：研究人员对比了小鼠 BAI1、BAI2 和 BAI3 的 NTD 序列，发现关键的 C1ql 识别残基在 BAI2 中保守，在 BAI1 中不保守。通过将 BAI1 和 BAI2 的 NTD 建模到 C1ql3-BAI3 复合物结构中，证实 BAI2 能与 C1ql3 结合，而 BAI1 不能，这是由于 BAI1 中 Thr65Arg 和 Glu60Arg 的替换分别导致与 C1ql3 的空间冲突和氢键连接破坏。同时，对不同物种 BAI NTD 序列的进化分析也支持这一结论。
验证 C1ql3 与 BAI 受体的结合特性：研究人员在 HEK293T 细胞表面表达 BAI3 和 BAI1，用 C1ql3 进行染色实验。结果表明，C1ql3 能与 BAI3 结合，不能与 BAI1 结合，BAI3 中 Thr65 突变为 Arg 会破坏结合，而改变 BAI1 的相应序列也无法恢复结合，这说明整体结构折叠和其他残基也会影响结合。此外，对 C1ql3-BAI3 界面关键残基的突变分析进一步验证了特定残基对二者相互作用的重要性。
比较 C1q-like 结构域与不同受体的结合模式：与已知的 Cbln1 与 GluD2 的结合模式相比，C1ql3 与 BAI3 的结合模式和化学计量比截然不同。Cbln1 的三聚体 C1q-like 结构域与一个 GluD2 NTD 结合，而 C1ql3 的三聚体 C1q-like 结构域与三个 BAI3 结合。同时，C1ql3 的结合还依赖 Ca²⁺离子，二者利用不同的表面区域与靶标结合。基于 C1ql3 的结构特点，研究人员推测它与 BAI3 可能形成六边形晶格，这或许在 GPCR 信号传导和突触形成中发挥重要作用，但这一推测还需进一步研究证实。
在结论与讨论部分，研究人员成功解析了 C1ql3 C1q-like 结构域与 BAI3 NTD 的复合物结构，揭示了一种全新的 C1q-like 结构域 / 受体复合物的几何形状和结合界面，表明 C1q 结构域具有多样的结合功能。同时发现 C1qls 可能促使突触 BAI adhesion-GPCRs 聚集，这为 C1qls 作为突触组织者的作用机制提供了新视角，也凸显了 adhesion-GPCR 在神经发育中的新功能。不过，关于 C1ql3 与 BAI3 形成六边形晶格的假设仍有待进一步探索。总的来说，这项研究为神经科学领域对大脑突触组织机制的理解提供了重要依据，为后续研究开辟了新方向，有望推动相关神经疾病机制及治疗方法的研究。