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在真菌生物工程应用中，传统冷冻保护剂（CPA）存在诸多问题。研究人员针对此，开展不同 CPA 配方对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）影响的研究。结果发现 T7（Suc + DMSO）配方下酵母复苏效果最佳。该研究为优化真菌保存提供依据。
在生物技术领域，真菌有着极为广泛的应用前景。从生产功能食品、制造疫苗，到重组生产各类药物，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）都发挥着关键作用。为了能让这些微生物更好地服务于未来研究，对其进行妥善保存至关重要。然而，当前的冷冻保存技术却面临着诸多挑战。
在冷冻过程中，低温虽能暂停微生物的活动，但却会给细胞带来严重伤害。细胞内和细胞外的水分会形成冰晶，这些冰晶就像微小的 “利刃”，无情地破坏细胞膜的结构，最终导致细胞在解冻后死亡。而冷冻保护剂（CPA）在这个过程中就显得尤为重要，它能帮助限制冰晶的形成，提高微生物的存活率。目前，常用的 CPA 主要是二甲亚砜（DMSO）和甘油。但 DMSO 具有一定的毒性，还可能引发细胞的表观遗传变化；甘油虽然毒性较低且成本效益高，但需要较高浓度才能发挥作用，而且后续还需要进行冗长的脱甘油过程，操作复杂，并且在这个过程中还可能引发渗透压冲击等问题。所以，开发新型 CPA 配方迫在眉睫。
在这样的背景下，来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）等机构的研究人员展开了深入研究。他们致力于探索不同 CPA 配方对酿酒酵母（ATCC 7754）的影响，希望能找到更高效的冷冻保存配方，提升酵母在冷冻保存后的复苏效果。这项研究成果发表在《Scientific Reports》上，为相关领域带来了新的曙光。
研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。首先，通过制备酵母接种物，调整细胞浓度后与不同 CPA 配方混合。接着，使用冷冻速率控制仪将样本冷冻保存。之后，采用液滴试验评估酵母细胞活力；利用蛋白质提取、液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）分析和串联质量标签（TMT）标记等技术对蛋白质组进行研究；借助 KEGG 自动注释服务器进行 KEGG 通路分析。
下面来看看具体的研究结果：
- 冷冻保护剂对酵母活力的影响：研究人员将 10 种不同的 CPA 配方与酵母细胞混合后冷冻保存 7 天，再通过液滴试验检测酵母的复苏情况。结果显示，传统的甘油（Gly）配方（T1）与无 CPA 的对照组（CT2）相比，酵母活力相似；而 5% DMSO 配方（T6）的酵母活力是 T1 的 3 倍。此外，不同配方组合的效果差异明显。例如，添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的配方（T3、T5）并没有提升酵母的复苏效果，T5 甚至表现出最低的复苏率。而海藻糖（Tre）和甘油（T4）的组合显著提高了酵母的复苏率，这表明两者可能存在协同保护机制。在所有组合中，蔗糖（Suc）和 DMSO 的组合（T7）表现最为出色，其冷冻保护效率显著高于其他组合、单独的糖类、DMSO 或甘油，展现出最高的复苏率。
- 冷冻保护剂对蛋白质组的影响：蛋白质组分析揭示了不同 CPA 配方处理后酵母蛋白质表达的变化。其中，基于海藻糖的配方（T2、T10）导致蛋白质表达变化最为显著，而 PVP 和甘油的组合（T5）变化最小。像 T7 配方，虽然蛋白质表达变化较大，但复苏率却是 T1 的 4 倍，显示出改进配方的优势。另外，T4 配方在蛋白质表达与对照组相似的情况下，冷冻后复苏率却提高了 2 倍多。从整体趋势来看，较高的存活率往往与较大的蛋白质表达变化相关，这意味着这些代谢变化对于提高酵母的存活比例至关重要。而且，无论是上调还是下调的蛋白质，在不同配方处理下，细胞器蛋白的变化最为明显，这表明冷冻保存对细胞器结构有显著影响。同时，冷冻保存也影响了酶的分布，进而影响生化途径。
- Pearson 相关性系数分析：通过该分析发现，不同配方之间存在不同程度的相关性。例如，T7 与 T2 的相关性较高（0.46），表明基于 DMSO 的二糖配方在作用机制上可能存在关联；T7 与 T8 呈现出强拮抗关系（0.80），说明基于 DMSO 和甘油的 CPA 作用机制不同。T4 与甘油基配方（T8、T1）以及单独的海藻糖配方（T10）相关性较强，这意味着甘油基二糖和糖类在作用机制上有相似之处，而海藻糖和蔗糖的作用机制则有所不同。
- 定量蛋白质组分析：通过热图和树形图对蛋白质表达进行分析，结果显示未经历冻融循环的 CT1 组蛋白质谱与其他组明显不同。含有蔗糖和海藻糖的配方（T9、T10）由于具有相似的冷冻保存机制，被归为同一簇（Cluster 2）。但当它们与非二糖 CPA 混合时，会被分到不同的簇中，这表明二糖与非二糖 CPA 混合会显著改变其冷冻保存效果。此外，只使用培养基作为 CPA 的 CT2 组与甘油主导的簇更为接近，这表明传统的甘油配方在蛋白质谱上与仅用培养基冷冻的细胞最为相似。
- KEGG 通路分析：研究共鉴定出 2299 种蛋白质，这些蛋白质涉及 73 种不同的信号通路。在冷冻保存过程中，不同的代谢途径受到不同的调控。例如，半乳糖代谢在部分配方组中被下调，这可能是为了降低真菌生长速率，节省能量以维持生存。而糖酵解、柠檬酸循环、戊糖磷酸途径、氮和硫代谢途径等在多数配方组中被上调，这些途径对于维持细胞活力、氧化还原平衡、信号转导、细胞膜完整性以及蛋白质合成和修复至关重要。不同配方对甘油磷脂代谢、脂肪酸生物合成、精氨酸生物合成、嘌呤和嘧啶代谢等途径的调控也有所不同，这些调控变化影响着细胞的生存和复苏。
综合上述研究，研究人员得出以下结论：在评估的 10 种不同配方中，T7（Suc + DMSO）是最优化的真菌复苏配方，展现出最高的酵母活力，是追求高细胞活力时的最佳选择；而 T4（Tre + Gly）在保证有效冷冻保护的同时，蛋白质表达变化较少，对细胞代谢干扰小，适用于对蛋白质组干扰敏感的实验或工作。通过全面的蛋白质组和 KEGG 通路分析，研究人员深入了解了酿酒酵母在冷冻保存后的适应性反应，明确了不同代谢途径在其中的重要作用。这项研究为优化酿酒酵母的冷冻保存技术提供了关键依据，也为其他生物的冷冻保存研究提供了有价值的参考，有望推动生物技术和工业应用中微生物保存技术的进一步发展。
