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本文通过对 1547 例肺癌患者进行回顾性分析，利用生物信息学工具 MIAmS 评估微卫星状态（MS），结合免疫组化（IHC）检测，发现肺癌中微卫星不稳定性（MSI）/ 错配修复缺陷（dMMR）极为罕见，不足 1%。但基于二代测序（NGS）的分析方法可有效识别这类患者，为免疫治疗决策提供指导。
引言
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，非小细胞肺癌（NSCLC）最为常见，且多在晚期或转移阶段被诊断出来。免疫检查点阻断抗体（ICIs）治疗虽改善了 NSCLC 患者的预后，但 PD - L1 表达与 ICIs 敏感性的关联仍不充分，寻找新的生物标志物意义重大。
微卫星不稳定性（MSI）是癌症的标志之一，与 DNA 错配修复（dMMR）系统缺陷有关，可作为免疫治疗反应的预测生物标志物，在结直肠癌和子宫内膜癌中常见，在 NSCLC 中则较为罕见。传统检测 MSI 的免疫组化（IHC）和聚合酶链反应（PCR）技术存在一定局限性，二代测序（NGS）技术可同时评估突变谱和 MSI 状态，研究团队此前开发并验证了用于确定肿瘤样本 MS 状态的软件 MIAmS。本研究旨在分析 1500 多例肺癌样本的 MS 状态，综合评估患者临床特征，将基于 NGS 的 MS 检测与 IHC 检测相结合，并分析相关分子改变、肿瘤突变负荷（TMB）和同源重组缺陷（HRD）状态。
材料和方法
- 患者和样本队列：回顾性筛选 2019 年 8 月至 2023 年 3 月提交至法国蒙彼利埃大学医院的 1547 例肺癌福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本，经训练的病理学家确定肿瘤细胞百分比≥30% 的样本纳入研究。研究获蒙彼利埃大学医院机构审查委员会批准，符合赫尔辛基宣言，从 MSI/dMMR 患者病历中获取临床病理数据和治疗反应信息。
- DNA 提取和定量：使用 Maxwell RSC DNA FFPE Kit 提取基因组 DNA，Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit 和 Qubit 荧光计进行定量。
- NGS 分析：采用 Advanta Solid Tumor NGS Library Prep Assay 和自动化 Juno 系统制备文库，对 7 个 MS 位点和 49 个肿瘤相关基因进行检测。测序后经生物信息学流程检测单核苷酸变异（SNVs）和小插入 / 缺失（indels），依据美国医学遗传学学院（ACMG）建议和公共数据库解读变异，仅纳入致病性、可能致病性或意义不明的变异。
- 基于 NGS 的 MS 状态测定：利用生物信息学工具 MIAmS 评估 MS 状态，其通过机器学习方法，经创建模型、预测 MS 状态等步骤，每个分类器会为样本分配 MSI 或 MSS 状态及 0 - 1 的置信分数，分数低于 0.5 则为 “未确定”。研究还开发了 MS_score 和确定性排序算法，依据 MS_score 对样本排序，得分大于 0 的样本被视为潜在 MSI 样本。
- MMR 免疫组化：对 FFPE 3 - μm 组织切片进行免疫组化，使用针对 MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2 的单克隆抗体，MMR 缺陷定义为在阳性内对照（基质细胞和 / 或淋巴细胞）存在时，任何 MMR 蛋白完全阴性核染色。
- 错配和同源重组修复基因面板分析及 HRD 状态测定：使用 Twist 文库制备试剂盒制备文库，检测 21 个 DNA 修复途径相关基因的改变。通过浅全基因组测序和 shallowHRD 生物信息学流程确定 HRD 状态，经多种工具进行变异解读和分类。
- TMB 状态测定：使用 OncoDEEP DNA Kit 制备文库，对 638 个基因进行检测，通过 OncoKDM 平台确定 TMB 状态。
结果
- 肺癌患者 MS 状态的回顾性分析：1547 例患者中，8 例（0.52%）MS_score > 0，其中 6 例（75.0%）经 IHC 检测为 dMMR，且这 6 例患者 MS_score 均≥2。除 1 例患者外，其余患者均显示 MLH1 和 PMS2 染色缺失，另 1 例患者为 MSH6 染色单独缺失。综合分析确定 1547 例患者中有 6 例（0.39%）为 MSI/dMMR 患者，且这些患者 MLH1 或 MSH6 基因均存在改变（致病性 / 无功能或意义不明变异 [VUS]）。
- MSI/dMMR 样本中的共现分子改变：6 例 MSI/dMMR 患者中，所有患者均有非功能性 TP53 改变或 VUS，且均有癌症相关基因改变，涉及 MAP - 激酶和 PI3K/AKT 信号通路。HRD 状态测定显示，3 例患者为明显阴性，2 例为中间型，1 例为阳性。患者 TMB 较高（21.4 ± 5.6 Mut/Mb），与癌症相关基因中致病性和 VUS 改变数量增多相关。
- MSI/dMMR 表型患者的临床特征：6 例 MSI/dMMR 患者中，66.6% 为男性，中位年龄 62.2 岁，均为现吸烟者或 former 吸烟者。疾病分期方面，2 例（33.3%）为 I/II 期，1 例（16.7%）为 III 期，3 例（50%）为 IV 期。不同患者治疗方式和预后不同，如患者 P7 接受放化疗联合 durvalumab 巩固治疗 1 年未复发，患者 P6 接受化疗免疫联合治疗后病情得到控制，而患者 P4 接受铂类双药化疗后预后较差，6 个月后死亡。
讨论
研究发现 1547 例肺癌患者中有 6 例（0.39%）为 MSI/dMMR 患者，与现有文献报道相符。对肺癌基因改变的研究发现，部分患者 MLH1 基因存在改变，影响蛋白功能，但机制与消化或妇科肿瘤不同，未发现 MLH1 基因启动子高甲基化。
患者 P7 肿瘤特征独特，有 17 个体细胞改变，但未明确 MSI/dMMR 表型的遗传原因，且存在 BRCA2 和 BRIP1 致病性改变及中间 HRD 评分。患者 P6 具有高 HRD 评分、MSH6 致病性改变但无表达缺失，且存在 CHEK2 致病性改变，其多种与 ICI 阳性反应相关的生物标志物可能解释对 ICI 的良好反应。
研究中 MSI NSCLC 患者的 TMB 计算结果与文献相符，但 TMB 作为 ICIs 疗效预测生物标志物存在局限性，其预测敏感性有限，且在部分癌症类型中与 ICIs 敏感性无直接关联。此外，所有 MSI/dMMR 患者均有吸烟史，提示吸烟与 MSI 发病机制可能存在关联，且多数患者为肺腺癌。
本研究利用 NGS 技术和生物信息学工具 MIAmS 进行 MSI 检测，开发的 MS_score 和确定性排序算法有效，与 MSISensor - pro 对比也凸显了优化生物信息学工具的重要性。尽管 MSI/dMMR 肺癌罕见，但确定 MS 状态对患者治疗管理有重要意义，尤其对神经内分泌肺癌。不过，研究存在局限性，缺乏晚期或转移性患者的免疫治疗数据，且回顾性分析可能低估其他类型肺癌中 MSI 的患病率。总体而言，肺癌中 MSI/dMMR 极为罕见，基于 NGS 的 MSI 分析是有价值的筛查方法，MS_score 为相关研究提供了有力的生物信息学解决方案。
