探秘海洋细菌：解锁聚羟基脂肪酸酯（PHA）降解新潜能，助力环保新征程

本文聚焦海洋细菌对聚羟基脂肪酸酯（PHA）的降解研究。从海洋环境中筛选出能产胞外 PHA 解聚酶的细菌，优化酶生产条件，发现菌株 SS1-2 降解能力强。该研究为海洋生物修复、减少塑料垃圾提供新思路，对可持续发展意义重大。

　　

研究背景

塑料材料因强度高、重量轻、耐用且耐环境腐蚀而被广泛应用。但塑料分解速度远慢于其使用周期，全球塑料垃圾年产量达 4 亿吨，仅 9% 被回收，大量塑料垃圾在生态系统中积累。新冠疫情期间，一次性塑料包装需求激增，进一步加剧了塑料垃圾问题。多数塑料源于石油，难以自然降解，会形成微塑料和纳米塑料，对海洋生态系统造成严重影响，因此，使用可生物降解塑料成为解决问题的重要途径。

聚羟基脂肪酸酯（PHA）是微生物合成的细胞内碳源和能源储存化合物，具有完全可生物降解性，在海洋环境中降解速度比非生物降解快 8 - 20 倍，被视为石油基塑料的可行替代品。PHA 可被多种微生物降解，其降解过程依赖于 PHA 解聚酶。目前已发现约 30 种有活性的 PHA 解聚酶，不同细菌产生的解聚酶对 PHA 的降解特性各异。本研究旨在从海洋环境中筛选具有 PHA 降解潜力的细菌，优化其产酶条件，为 PHA 降解及海洋生物修复提供理论依据。

实验材料与方法

1. 材料采集：从泰国达叻府的 Tan Khu 湾采集海洋垃圾和海水样本，用于筛选聚 [(R)-3 - 羟基丁酸]（P (3HB)）降解细菌。
2. 细菌分离与筛选：采用改良的 Vigneswari 等人的方法，将样本在添加 0.1% P (3HB) 的人工海水盐肉汤（ASW - P (3HB)）中富集培养，振荡培养 24 - 48 小时后，进行系列稀释并在 ASW - P (3HB) 琼脂平板上培养 1 - 4 周。通过观察菌落周围是否出现透明圈来筛选 P (3HB) 降解细菌，将纯菌落保存于 4°C 用于后续实验。
3. 细菌降解特性监测：采用点接种法将分离菌株接种于 ASW - P (3HB) 平板，30°C 培养 1 个月，每周测量透明圈直径，计算降解指数（降解指数 = 透明圈直径 (cm)/ 菌落直径 (cm)）。同时，将菌株在 ASW - P (3HB) 液体培养基中振荡培养，200rpm、30°C 条件下，每 24 小时取样分析酶活性，选择酶活性最高的菌株进一步研究。
4. 菌株鉴定：对酶活性最高的菌株 SS1-2 进行形态学和分子生物学鉴定。通过扫描电子显微镜观察其形态特征，提取基因组 DNA，使用通用细菌引物 20F 和 1500R 扩增 16S rRNA 基因，进行 PCR 扩增和测序，利用 BioEdit 软件与 GenBank 数据库比对，采用邻接法（NJ）构建系统发育树。
5. 酶生产优化 - 单因素法：采用单因素法优化培养基和培养条件，研究不同氮源（氯化铵（NH₄Cl）、硫酸铵 [(NH₄)₂SO₄]、磷酸氢二铵 [(NH₄)₂HPO₄]、尿素 [(NH₂)₂CO]）、温度（30°C、35°C、37°C、40°C）和 pH（5.0、5.5、6.0、6.8、7.5）对解聚酶生产的影响。每个氮源添加量为 1%，在 200rpm、30°C 条件下培养 6 天；在确定最佳氮源后，研究不同温度和 pH 对酶活性的影响，每天取样检测酶活性。
6. 酶生产优化 - 响应面法：运用响应面法（RSM）中的中心复合设计（CCD）研究影响解聚酶生产的因素。考察固体负载（X₁，0.02 - 0.58%）和氯化铵浓度（X₂，0.02 - 0.58%）两个因素，分为 5 个水平（?α，?1，0，+1，+α，α = ±1.41），进行 11 次试验。使用 Design Expert 软件分析数据，建立二阶多项式模型，评估模型拟合度和各因素的显著性。
7. 酶活性测定：参照 Vigneswari 等人的方法测定 P (3HB) 解聚酶活性。在 0.1M 磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中，加入 0.16% P (3HB) 颗粒，超声处理后，取 0.1mL 酶溶液与 0.9mL P (3HB) 悬浮液混合，37°C 孵育 30min，在 650nm 处测定吸光度，定义 1 个酶活性单位为每分钟每毫升酶降解的 P (3HB) 量（mg/mL/min）。

实验结果与分析

1. P (3HB) 降解细菌的分离与筛选：通过在 ASW - P (3HB) 培养基中培养，成功分离出 6 株能降解 P (3HB) 的细菌，这些菌株在菌落周围形成了透明圈，表明它们具有分解 P (3HB) 的能力。
2. 固体和液体条件下 PHB 降解细菌的监测：对 6 株分离菌株的降解指数进行测试，发现菌株 SS1-2 在培养 1 周时降解指数最高，为 1.44；菌株 SS2-2 在培养 4 周时降解指数最高，为 2.27。所有分离菌株的降解指数均大于 1.00，表明它们均为 PHA 降解菌。由于 SS1-2 在 1 周时降解指数最高，因此选择该菌株进行后续解聚酶生产条件的优化研究。
3. 菌株 SS1-2 的鉴定：扫描电子显微镜观察显示，菌株 SS1-2 呈杆状，革兰氏染色后细胞呈粉红色。16S rRNA 基因序列分析表明，该菌株与Pseudooceanicola antarcticus CGMCC 1.12662 相似度达 97.81%，与P. algae和P. aestuarii相似度均为 97.60%。系统发育分析显示，菌株 SS1-2 与上述三种菌相关，但又独立于它们，推测可能是Pseudooceanicola属的新物种，不过还需进一步研究基因组 DNA 序列来确定。
4. 单因素法优化解聚酶生产
   • 氮源的影响：研究不同氮源对解聚酶生产的影响发现，NH₄Cl 是最有利于酶生产的氮源。在添加 1% NH₄Cl 的 ASW - P (3HB) 液体培养基中，30°C 培养 6 天后，酶活性最高，为 0.027 ± 0.00mg/mL/min。尿素不仅对酶合成无促进作用，还抑制 P (3HB) 解聚酶活性，使其降至 0.00U/mL。
   • 温度的影响：理想的 P (3HB) 解聚酶合成温度范围为 30 - 40°C，30°C 时酶合成速率最高，为 0.0256mg/mL/min。
   • pH 的影响：初始 pH 对 P (3HB) 解聚酶生产有显著影响。在初始 pH 为 7.5 和 6.8 时，酶产量较高，分别为 0.0280mg/mL/min 和 0.0267mg/mL/min；在 pH 5.0 - 6.5 时，酶产量较低。综合考虑，选择初始 pH 7.5 进行后续培养基优化试验。
   
   
5. 响应面法优化解聚酶生产
   • 模型建立与验证：采用 CCD 设计，研究固体负载和 NH₄Cl 浓度对解聚酶生产的影响。结果表明，当底物负载和 NH₄Cl 浓度均为 0.5% 时，P (3HB) 解聚酶产量最高，为 0.0350mg/mL/min；当底物负载为 0.30%、NH₄Cl 浓度为 0.02% 时，产量最低，为 0.0121mg/mL/min。建立的二阶多项式模型为 Y = - 0.023 + 0.00464X₁ + 0.00588X₂ + 0.00271X₁X₂ - 0.00102X₂²，模型的决定系数R² = 0.992，调整R² = 0.9841，表明模型拟合度良好。
   • 因素交互作用分析：底物负载和 NH₄Cl 浓度的交互作用对 P (3HB) 解聚酶活性有显著影响。在 0.1 - 0.5% 范围内，增加底物负载和 NH₄Cl 浓度可提高酶活性；超过 0.5% 时，酶活性下降。通过验证实验，在优化条件下（底物负载 0.5%，NH₄Cl 0.5%），酶活性达到 0.0329mg/mL/min，与预测值接近，表明 RSM 分析可有效预测和优化发酵培养基。
   • 最佳条件及意义：确定菌株 SS1-2 解聚酶生产的最佳条件为底物负载 0.5%、NH₄Cl 浓度 0.5%，此时酶活性为 0.05mg/mL/min，比原始培养基（底物浓度 0.1%）提高了 5.32 倍。NH₄Cl 在酶生产中具有双重作用，适宜浓度可促进酶合成，过高浓度则抑制酶生产。
   
   

研究结论

本研究利用统计方法从海洋环境中发现了一株能高效降解 P (3HB) 的细菌菌株 SS1-2，初步鉴定其与Pseudooceanicola antarcticus相似。优化后的产酶条件为底物负载 0.5%、NH₄Cl 浓度 0.5%、温度 30°C、pH 7.5，在此条件下酶活性显著提高。该研究对海洋生物修复、减少海洋塑料垃圾具有重要意义，为可持续发展提供了新的方向。然而，Pseudooceanicola antarcticus在工业应用前还面临酶活性优化和规模化生产等挑战，需要进一步研究解决。