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为探究作物植物中染色体外环状 DNA（eccDNAs）在应对环境线索，尤其是营养胁迫方面的作用，研究人员以水稻为对象展开研究。结果发现 eccDNAs 在水稻生长和应对氮、磷胁迫中发挥重要作用，该研究为理解植物适应机制提供新视角。
在生命的微观世界里，植物细胞中隐藏着许多神秘的 “小秘密”，染色体外环状 DNA（eccDNAs）便是其中之一。eccDNAs 广泛存在于各种真核生物中，以往研究发现它在基因组可塑性方面扮演着关键角色，比如在酵母中，它能帮助酵母适应环境压力，还与肿瘤细胞中癌基因的扩增有关。在植物领域，虽然已在多种植物中发现了 eccDNAs 的身影，像拟南芥、甘蔗、水稻和苋属植物等，并且知道它在杂草抗草甘膦方面发挥作用，但在作物植物中，eccDNAs 面对环境压力，特别是营养胁迫时，到底有着怎样的表现，这个问题一直没有答案。
水稻，作为全球一半以上人口的主食，也是基因组研究的优秀模式植物，在生长过程中会遭遇各种环境挑战，其中营养胁迫对其生长发育影响重大。为了揭开水稻中 eccDNAs 在营养胁迫下的神秘面纱，南京农业大学的研究人员联合国外团队展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解植物应对营养胁迫的机制提供了全新的视角。
研究人员运用了多种关键技术方法来开展这项研究。在样本处理方面，种植水稻并设置不同的营养处理组获取样本。测序技术上，采用牛津纳米孔长读长测序来分析 eccDNAs，还利用 ATAC 测序（Assay for Transposase-Accessible Chromatin sequencing，一种用于检测染色质可及性的技术）验证 eccDNA 的高密度区域。数据分析上，使用 ecc_finder 等软件进行 eccDNA 的识别和分析。
下面来看看具体的研究结果：
- eccDNAs 源自水稻基因组的不同区域：研究人员收集了不同处理下水稻地上部分组织，提取并纯化 eccDNAs，经扩增后进行测序。分析发现，eccDNA 大小分布在 200bp 到 37kb 之间，平均大小约 500bp，且广泛分布于水稻基因组，在着丝粒周围和着丝粒区域密度最高，这些区域与转座元件（TEs）和 DNA 甲基化密度高的区域重叠。同时，对 eccDNAs 进行分类，发现 30.3% 的 ID-eccDNAs 与基因区域重叠（ecGenes），15.8% 映射到基因上游 2kb 区域，8.8% 映射到下游 2kb 区域，45.1% 位于基因间区域；51.2% 的 ID-eccDNAs 与 TEs 重叠（ecTEs），40.3% 与非编码 RNA 重叠（ecNon-codingRNAs）123。
- 基因重叠的 eccDNAs（ecGenes）在水稻生长过程中动态变化：研究人员在水稻生长的不同阶段，分析了 ecGenes 的变化。在短期（Ctrl_D1 与 Ctrl_D3）、中期（Ctrl_D1 与 Ctrl_D7）和长期（Ctrl_D1 与 Ctrl_D14）的最佳生长条件下，通过 GMPR 归一化和 EMDomics 差异分析，发现不同阶段的 ecGenes 存在显著差异。例如，短期生长阶段，863 个专属 ecGenes 参与生殖系统发育、氮化合物代谢过程等；中期生长阶段，专属 ecGenes 涉及花发育等过程；长期生长阶段，专属 ecGenes 与氮化合物代谢过程、DNA 损伤反应途径等有关456。
- 基因重叠的 eccDNAs 对氮胁迫作出响应：氮缺乏是影响植物生长的常见环境胁迫。研究人员对水稻进行短期（3 天）和长期（7 天）的低氮（LN）处理，发现短期 LN 处理下，2424 个专属 ecGenes 显著富集于氮化合物代谢过程；长期 LN 处理下，1033 个专属 ecGenes 与氮化合物运输等过程相关。此外，通过 RNA-seq 分析发现，ecGenes 与染色体上差异表达基因（DEGs）之间存在复杂关系789。
- 基因重叠的 eccDNAs 对磷胁迫作出响应：除氮胁迫外，植物还常面临磷缺乏的问题。研究人员对水稻进行短期（7 天）和长期（14 天）的低磷（LP）处理，结果显示短期 LP 处理下，556 个专属 ecGenes 参与组织发育等过程；长期 LP 处理下，348 个专属 ecGenes 与氮化合物代谢过程、调控自噬等有关。同样，ecGenes 与染色体 DEGs 之间存在复杂关联101112。
- 营养胁迫导致水稻中与 TEs 重叠的 eccDNAs 发生变化：研究人员定量分析了与 TEs 重叠的 eccDNAs（ecTEs）和全长重复单元（full-length ecRepeatUnits），发现氮、磷胁迫会改变 ecTEs 中 DNA 转座子和反转录转座子的比例，且延长胁迫时间影响更显著。同时，在营养胁迫下，Stowaway 和 Kiddo 等 DNA 转座子相关的全长 ecRepeatUnits 数量和分布也发生变化131415。
- 水稻中多片段 eccDNAs 的鉴定与验证：研究人员利用 eccDNA_RCA_Nanopore 工具鉴定出多片段 eccDNAs（MF-eccDNAs），其序列来源于水稻基因组的不同区域。例如，以细胞色素 c 氧化酶亚基 2（Os04g0343050）和假定的细胞色素 P450（Os05g0372300）为核心基因的 MF-eccDNAs 在氮、磷胁迫下有不同程度的积累161718。
- ATAC-seq 有效验证了水稻 eccDNAs 的高密度区域：研究人员对 Ctrl_D7、LN_D7 和 LP_D7 的水稻样本进行 ATAC-seq，通过特定分析流程，确定了 14 个 eccDNAs 的高密度区域，部分区域在氮胁迫下 eccDNA 的读数显著增加192021。
研究结论和讨论部分指出，该研究全面分析了水稻中的 eccDNAs，揭示了其在植物发育和应对营养胁迫中的重要作用。eccDNAs 可能通过改变 ecGenes 和 ecTEs 的丰度来影响水稻生长和对营养胁迫的响应。研究还提出了 LTR 介导的同源重组机制可能是水稻 MF-eccDNAs 的起源，以及 Stowaway 和 Kiddo 等 DNA 转座子在 eccDNA 动态变化中的潜在作用。然而，仍有许多问题有待进一步研究，如 ecGenes 调节染色体基因表达的具体机制等。总体而言，这项研究为深入理解水稻 eccDNAs 的功能和植物应对环境胁迫的调控机制提供了重要依据，为后续研究开辟了新方向 。
