脂质纳米颗粒（LNPs）在肝人源化小鼠中的递送障碍与突破：血清因子与靶向策略的关键作用

本文研究脂质纳米颗粒（LNPs）在肝人源化小鼠中的应用。发现 LNPs 能高效递送至小鼠肝细胞，但在人肝细胞中存在障碍，血清因子是主要原因。不过，三价 N - 乙酰半乳糖胺（TriGalNAc）修饰的 LNPs 可克服该障碍，为相关研究和治疗提供重要参考。

　　

研究背景

脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles，LNPs）作为核酸药物递送载体，在多种疾病治疗中展现出潜力，如用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性的 Onpattro，以及新冠疫苗等。其能高效富集于肝脏，这使其成为众多肝脏疾病基因治疗的重要工具。然而，LNPs 的安全性虽被广泛接受，但仍存在潜在风险，如可能刺激宿主免疫反应和引发毒性，所以评估新 LNP 制剂在合适模型系统中的效果十分必要。

肝人源化嵌合小鼠模型的出现，为研究人类肝脏疾病、药物开发、安全性和毒理学提供了有力手段。这些模型支持原代人肝细胞（primary human hepatocytes，PHHs）在小鼠肝脏中定植，可用于研究单基因遗传病、肝脏基因编辑、感染性疾病（如乙肝病毒、丙肝病毒、疟疾等）。在本研究中，科研人员利用肝人源化 NSG - PiZ 和 FRG 小鼠模型，比较不同离子化脂质的 LNPs 对人肝细胞和小鼠肝细胞的转导效率，旨在为基于 LNP 的治疗策略提供参考。

实验设计

实验选用肝人源化 NSG - PiZ 和 FRG 小鼠，对其进行分组，分别给予 PBS 或携带DasherGFP mRNA 的不同 LNP 制剂（LNP1、LNP2、LNP3），通过静脉注射给药。实验过程中监测小鼠体重、血液生化指标（如血清丙氨酸转氨酶 ALT、天冬氨酸转氨酶 AST）、血常规（包括网织红细胞、红细胞 RBC、血红蛋白 HGB 等）变化。实验结束后，对小鼠肝脏进行组织学分析，检测DasherGFP表达、mRNA 分布，还通过单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）分析潜在 LNP 受体表达，以探究 LNPs 在肝人源化小鼠中的递送效果及机制。

实验结果

1. 肝转基因表达：给予 LNP 后，多数 NSG - PiZ 和 FRG 小鼠肝脏检测到DasherGFP表达，但表达模式在不同小鼠品系和 LNP 制剂间存在差异。经 H&E 和免疫荧光染色发现，DasherGFP仅在小鼠肝细胞中表达，人肝细胞中未检测到。这表明，测试的 LNPs 能有效转染小鼠肝细胞，却无法转染人肝细胞。
2. DasherGFP mRNA 生物分布：RNAscope 分析显示，不同 LNP 制剂处理后，DasherGFP mRNA 在小鼠肝细胞和人肝细胞中的分布不同。在 NSG - PiZ 小鼠中，所有 LNP 制剂处理后，DasherGFP mRNA 在小鼠肝细胞胞质中呈弥散分布，在人肝细胞周围窦状隙也有分布，但不在人肝细胞胞质内。FRG 小鼠中，LNP1 和 LNP2 处理后类似，LNP3 处理后，DasherGFP mRNA 在小鼠和人肝细胞胞质中均缺失。这进一步证实，人肝细胞对测试的 LNPs 摄取有限，且 LNP3 在 FRG 小鼠中对小鼠肝细胞的摄取也可能受限。
3. LNP 给药的耐受性：LNP 给药后，部分小鼠出现轻微体重下降，血清 ALT 和 AST 短暂升高，提示肝脏有损伤，但 48 小时后大多恢复。同时，部分 LNP 处理小鼠的造血参数有变化，如网织红细胞和 RBC 计数减少、HGB 和平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）降低、平均红细胞体积（MCV）增加、短暂血小板减少等。不过，总体上这些变化未导致明显毒性，且 NSG - PiZ 和 FRG 小鼠的反应相似。
4. 单细胞分析潜在 LNP 受体表达：通过 scRNA - seq 分析 NSG - PiZ 小鼠肝脏细胞和 snRNA - seq 分析 FRG 小鼠肝脏细胞核，研究潜在 LNP 受体（如载脂蛋白 E ApoE、低密度脂蛋白受体 LDLR、去唾液酸糖蛋白受体 ASGR）的表达。结果显示，人肝细胞中这些受体的表达并不低于小鼠肝细胞，表明受体表达缺乏不太可能是 LNPs 不能被人肝细胞摄取的主要原因。
5. 血清因子对 LNP 摄取的影响：给 NSG - PiZ 小鼠注射含 SM - 102 的 LNP - eGFP mRNA 后，发现 GFP 仅在小鼠细胞中表达，不在人细胞中表达。体外实验表明，正常小鼠血清存在时，SM - 102 LNPs 可转染 PHH，但人血清或嵌合 NSG - PiZ 血清存在时则不能。进一步研究发现，嵌合 NSG - PiZ 血清中的抑制因子导致了这种现象，且其他含不同离子化脂质的 LNPs 也受影响。虽然重组人 ApoE 可抑制 PHH 转染，但去除 ApoE 的嵌合血清仍有抑制作用，说明还有其他血清因子参与。此外，未移植的 NSG - PiZ 血清也能抑制转染，而 NSG 小鼠血清则支持转染，暗示 NSG - PiZ 遗传背景中的某种小鼠因子可能抑制人肝细胞对 LNPs 的摄取。
6. 靶向 LNP 对人肝细胞的转染：由于血清因子抑制人肝细胞对 LNPs 的摄取，研究人员尝试使用靶向 LNP。给嵌合 NSG - PiZ 小鼠注射展示三价 N - 乙酰半乳糖胺（TriGalNAc）的 LNP - GFP mRNA 后，通过流式细胞术发现，小鼠和人细胞中均检测到 GFP 表达，表明这种靶向 LNP 可通过 ASGR 途径实现对人肝细胞的转染。

讨论

本研究表明，LNPs 在肝人源化小鼠中存在物种特异性和品系依赖性的摄取差异。不同 LNP 制剂在 NSG - PiZ 和 FRG 小鼠中的基因表达水平不同，可能与 PHH 定植水平有关，但具体原因还需进一步研究。尽管此前在小鼠和非人灵长类动物研究中，LNPs 展现出高效的肝脏递送能力，但在肝人源化小鼠中，人肝细胞对 LNPs 的摄取存在障碍，这可能限制其在相关疾病研究和治疗中的应用。

NSG - PiZ 和 FRG 小鼠的遗传背景差异可能影响 LNP 摄取，如 FRG 小鼠的FAH基因敲除和 NSG - PiZ 小鼠的 PiZ 等位基因敲入，可能改变小鼠肝细胞表面受体或分泌的血液因子，进而影响 LNPs 的摄取。体外实验也支持这一观点，NSG - PiZ 小鼠血清可阻断 LNP SM102 转染，而 NSG 小鼠血清则不会。此外，本研究未明确人肝细胞摄取 LNPs 受限的具体机制，虽然已知 LNPs 的内吞作用与 ApoE、LDLR 等有关，但在肝人源化小鼠中，由于人和小鼠蛋白同时存在，情况更为复杂，非实质细胞也可能通过依赖脂质化学的途径摄取 LNPs。

尽管 LNP 给药后对血清转氨酶水平和造血细胞数量有一定影响，但这些影响是短暂的，未导致明显毒性。不过，由于肝人源化小鼠的肝脏本身不健康，基线转氨酶水平较高，且造血发育异常，所以对 LNPs 毒性的评估还需进一步研究。总体而言，本研究提示，使用 LNPs 在肝人源化小鼠中进行 mRNA 递送研究时存在局限性。未来改进 LNPs 的脂质化学或靶向部分，如使用 TriGalNAc 修饰的 LNPs，可能提高人肝细胞对 mRNA 的摄取效率。此外，研究嵌合小鼠血清中影响 LNP 摄取的具体因子，探索共给药必需血清成分或阻断抑制因子的方法，将有助于推动 LNPs 在临床治疗中的应用。