多重敲除eIF4E基因家族赋予烟草对马铃薯Y病毒属的持久广谱抗性研究

为解决马铃薯Y病毒属(Potyviruses)抗性易被突破和抗谱狭窄的问题，研究人员通过CRISPR/Cas9技术同时敲除烟草真核翻译起始因子4E(eIF4E)基因家族多个成员，发现eIFiso4E-T和eIFiso4E-S双敲除结合va位点可实现对PVY抗性突破株系及TVBMV、ChiVMV的持久广谱抗性，为作物抗病毒育种提供新策略。该成果发表于《aBIOTECH》。

　　

马铃薯Y病毒属(Potyviruses)是危害作物最严重的RNA病毒类群，每年造成全球数十亿美元经济损失。传统抗性育种依赖单个eIF4E基因突变，但病毒通过VPg蛋白变异极易产生抗性突破(RB)株系，且不同病毒利用不同eIF4E亚型感染宿主，导致抗谱狭窄。中国云南烟草主产区长期种植含va抗性位点（缺失eIF4E1-S基因）的品种，虽有效控制马铃薯Y病毒(PVY)，但近年出现抗性突破株系，同时烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)流行加剧，亟需开发更持久的广谱抗性策略。

云南省烟草农业科学院联合浙江大学的研究团队通过田间调查发现，va烟草中PVY感染率仅5.8%，但TVBMV感染率高达68.1%。通过分子进化分析发现，PVY抗性突破株系的VPg蛋白第105位赖氨酸突变为谷氨酰胺(K105Q)是关键变异。酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补(BiFC)实验证实，突变后的VPg^K105Q不仅能结合原有靶标eIF4E1-S，还能劫持新靶标eIFiso4E-T。研究人员利用CRISPR/Cas9技术在va背景烟草中系统敲除eIF4E家族成员，发现：单独敲除eIFiso4E-T使植株对PVY野生型和抗性突破株均产生完全抗性；而敲除eIFiso4E-S则赋予对TVBMV完全抗性和对ChiVMV部分抗性。最终获得的va eifiso4e-t eifiso4e-s三重突变体表现出对三种病毒的综合抗性，且生长发育不受影响。

关键技术包括：1) 云南13个县市497份烟草样本的病毒血清学检测；2) PVY VPg突变体的反向遗传学分析；3) CRISPR/Cas9介导的多基因编辑系统；4) 蛋白互作验证体系(Y2H和BiFC)；5) 转基因植株的病毒接种和ELISA检测。

【Field survey of potyviruses】田间调查显示va烟草对PVY保持较高抗性(感染率5.8% vs 敏感品种22.5%)，但TVBMV成为优势病原(68.1%)，揭示单一基因抗性的局限性。

【K105 mutation in VPg】发现VPg^K105Q突变是PVY突破va抗性的关键，接种实验证实该突变使系统感染时间提前7天。

【Screening of eIF4E homologs】蛋白互作实验揭示VPg^K105Q可结合eIF4E1-S、eIF4E1h-T和eIFiso4E-T，其中eIFiso4E-T的核定位暗示其作为新易感因子的功能。

【CRISPR/Cas9-mediated mutation】基因编辑获得eIFiso4E-T单敲除株系对PVY抗性突破株的完全抗性，证明该亚型是RB株系的关键宿主因子。

【Knocking out eIFiso4E-S】eIFiso4E-S敲除使va烟草对TVBMV产生完全抗性，对ChiVMV抗性提升80%，表明不同病毒利用不同eIF4E亚型组合。

【Triple mutant】三重突变体va eifiso4e-t eifiso4e-s同步抵抗三种病毒，且无生长缺陷，得益于烟草异源四倍体中eIF4E家族的功能冗余。

该研究首次阐明PVY抗性突破的分子机制——VPg^K105Q通过招募eIFiso4E-T实现感染，并创新性地提出"多基因叠加编辑"策略。相比单基因抗性，同时破坏多个病毒易感因子可显著延缓抗性突破，且抗谱覆盖三种重要病毒。研究建立的CRISPR编辑体系为其他多倍体作物抗病毒育种提供范本，田间验证的eIF4E基因组合为设计持久广谱抗性提供了分子靶标库。值得注意的是，云南田间TVBMV的流行提示作物抗性改良需考虑地域性病毒组成，而eIF4E1h-T的"诱饵"功能为理解抗性持久性提供了新视角。该成果为应对病毒快速进化带来的抗性失效挑战提供了切实可行的解决方案。