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在宏基因组研究中，为探究微生物群落，研究人员开展了关于微生物分子方法对纳米孔测序自适应采样影响的研究。结果表明 DNA 提取方法和测序化学会影响宏基因组分析，自适应采样可有效富集低丰度基因组。这为优化研究提供了指导。
在微生物研究的奇妙世界里，宏基因组学（Metagenomics）就像一把神奇的钥匙，帮助科学家们探索微生物群落的奥秘。随着科技的飞速发展，下一代测序技术，尤其是纳米孔测序技术，为宏基因组学研究带来了新的曙光。然而，在这个充满挑战的领域，从微生物群体中获取无偏差的样本材料一直是个难题。就好比在一堆杂乱的拼图碎片中，想要准确找到所有正确的碎片并拼出完整的图案并不容易。同时，不同的实验方法和技术选择也可能像隐藏的 “小怪兽”，悄悄影响着研究结果的准确性。比如，DNA 提取方法可能会因为对不同微生物的裂解效果不同，导致最终获取的 DNA 样本存在偏差；测序化学的选择也可能影响数据的质量和基因组组装的准确性。为了解决这些问题，来自英国朴茨茅斯大学（University of Portsmouth）和巴斯大学（University of Bath）等机构的研究人员展开了深入研究 。
他们的研究成果发表在《Environmental Microbiome》杂志上。研究人员通过一系列实验，旨在评估微生物分子方法对纳米孔测序自适应采样（Adaptive sampling）在宏基因组研究中的影响。
在研究过程中，研究人员用到了几个关键的技术方法。首先是 DNA 提取技术，他们选取了 5 种市售的 DNA 提取试剂盒，从 3 个不同公司获取，对 ZymoBIOMICS 微生物群落标准品（ZymoBIOMICS Microbial Community Standard，ZMC）进行 DNA 提取，以比较不同试剂盒的效果。其次是测序技术，利用牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）的两种连接化学试剂盒（LSK109 和 LSK112 Q20+）进行纳米孔测序，并采用自适应采样技术对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因组进行实时富集。此外，还运用了 16S rRNA 扩增子测序、宏基因组组装分析等技术对实验结果进行评估 。
研究结果主要从以下几个方面展开：
- DNA 提取试剂盒对多样性估计的影响：研究人员通过分析不同 DNA 提取试剂盒提取的样本的 α 多样性和 β 多样性，发现不同试剂盒产生的多样性指标虽在某些方面相似，但在群落组成上存在显著差异。例如，基于主坐标分析（Principal Coordinate Analysis，PCoA）的 β 多样性分析显示，不同试剂盒的样本明显聚类，表明试剂盒存在特异性偏差。进一步分析发现，革兰氏阳性菌属在大多数试剂盒中代表性不足，而革兰氏阴性菌属则过度代表。在比较不同试剂盒时，MB 和 BM 试剂盒在对 ZMC 的代表性上偏差相对较小，PF 试剂盒在与预期丰度的相似性上表现最佳123。
- 测序化学对宏基因组丰度谱的影响：研究人员使用 BM 试剂盒提取 ZMC 的全宏基因组 DNA，然后分别用 LSK109 和 LSK112 化学试剂盒进行测序。结果发现，两种测序化学在各微生物的 reads 比例上没有显著差异，但与预期分布相比都存在显著差异。主要表现为假单胞菌（Pseudomonas）的过度代表和某些革兰氏阳性菌属的代表性不足4。
- Q20+ ONT 化学对宏基因组样本组装准确性和完整性的影响：比较使用 LSK109 和 LSK112 化学试剂盒进行全基因组宏基因组组装的质量，发现两者在基因组完整性指标上相似，但 LSK112 化学试剂盒在减少每 Mb 的插入缺失（indels）方面表现更好，不过其组装结果的 N50 值较低，contigs 数量较多，表明组装更碎片化567。
- 自适应采样对富集低丰度基因组的效果：研究人员利用自适应采样技术对 ZMC 中的酿酒酵母进行富集。结果显示，自适应采样显著提高了酿酒酵母基因组的富集比例，LSK109 和 LSK112 化学试剂盒分别实现了 4.8 倍和 6.8 倍的富集。不过，自适应采样导致数据总产量降低，且不同化学试剂盒在基因组覆盖度和深度上存在差异，如 LSK109 的覆盖度更高，但两者在含有 rRNA 基因的区域都有更高的富集89。
研究结论和讨论部分指出，DNA 提取方法对微生物群落组成的估计有重要影响，采用珠磨法（Bead-beating）的试剂盒在提取难裂解微生物时偏差较小，但可能影响 DNA 片段长度。测序化学对宏基因组组装的连续性和完整性影响较小，主要作用是提高准确性和减少 indels。自适应采样是一种强大的技术，可有效富集宏基因组样本中的特定物种，但由于其对通量的影响，使用时需谨慎考虑。此外，研究还发现实验中的一些外部因素，如光对测序通量也有影响。总体而言，该研究为宏基因组研究中实验方法的选择和优化提供了重要的参考，有助于研究人员更准确地开展微生物研究，推动环境和临床微生物学领域的发展 。
