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帕金森病（PD）中，线粒体去泛素化酶 USP30 负调控 PINK1 - parkin 驱动的线粒体自噬，抑制 USP30 或可保护多巴胺能神经元，但小分子特异性抑制 USP30 的分子机制不明。研究人员通过嵌合蛋白工程，解析了 USP30 与抑制剂复合物晶体结构，为基于结构的药物设计提供依据。
帕金森病是一种常见的神经退行性疾病，其特征为黑质中多巴胺能神经元的进行性丧失。目前，针对帕金森病的治疗手段有限，深入探究其发病机制并寻找有效的治疗靶点至关重要。在帕金森病的发病过程中，线粒体功能障碍起着关键作用，而线粒体自噬（mitophagy）作为一种选择性清除受损线粒体的机制，对于维持神经元的正常功能至关重要。线粒体去泛素化酶（DUB）泛素特异性蛋白酶（USP）30，是线粒体质量控制的关键负调节因子，它能够去除线粒体膜外部分蛋白上的泛素，进而抑制 PINK1 - parkin 驱动的线粒体自噬过程。大量研究表明，抑制 USP30 可通过增加线粒体自噬水平，保护多巴胺能神经元免受 α - 突触核蛋白相关的毒性影响，因此，USP30 成为了治疗帕金森病极具潜力的药物靶点。然而，尽管已有多种小分子 USP30 抑制剂被发现，其中部分已进入临床试验阶段，但这些抑制剂在分子水平上如何实现对 USP30 的高效特异性抑制，其具体机制尚不清楚。这一知识缺口严重阻碍了 USP30 抑制剂的进一步优化和开发，也使得基于结构的药物设计难以有效开展。
为了解决这些问题，德国马克斯?普朗克分子生理学研究所（Chemical Genomics Center, Max Planck Institute of Molecular Physiology）和多特蒙德工业大学（Department of Chemistry and Chemical Biology, TU Dortmund University）的研究人员开展了深入研究。他们通过构建嵌合蛋白，解析了人 USP30 与特异性抑制剂复合物的晶体结构，揭示了小分子特异性抑制 USP30 的分子基础，为基于结构的药物设计开辟了新途径。该研究成果发表在《Nature Structural & Molecular Biology》杂志上。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过克隆技术构建了多种嵌合 USP30 蛋白表达载体，并在细菌中表达和纯化了相应的蛋白。其次，利用晶体学技术，对优化后的 USP30 构建体与抑制剂的复合物进行结晶，并收集和分析衍射数据，从而解析其晶体结构。此外，还运用了生物化学和细胞生物学实验方法，如 Ub - RhoG 切割实验、热迁移实验、细胞内泛素探针竞争实验等，来评估蛋白的催化活性、稳定性以及抑制剂的作用效果 。
研究人员首先设计并表征了嵌合 USP30 构建体。他们从先前获得的人 USP30 工程构建体（construct 1 (c1)）出发，鉴于其结晶困难，通过系统分析人类 USP 去泛素化酶的晶体结构，发现缺乏锌离子的手指亚结构域的 USP DUBs 可能具有更高的结晶倾向。于是，研究人员设想构建嵌合 USP30 催化结构域，用其他 USP DUBs 的等效区域序列替换 USP30 的手指亚结构域，以促进结晶。经过一系列实验，他们成功构建并筛选出 15 种嵌合构建体。实验结果表明，包含 USP14 手指和 USP35 盒 4 - 5 插入的 USP30ch3构建体，不仅具有未改变的催化活性，还显示出更高的蛋白质稳定性，且能与泛素探针 Ub - PA 有效结合 。
接着，研究人员对嵌合 USP30 - (USP14 - USP35) 构建体进行抑制研究。由于化合物 39 在水性缓冲液中溶解度较差，他们合成了溶解度增强的衍生物 NK036。研究发现，NK036 虽然效力略有下降，但能有效抑制 USP30 和 USP30ch3，且提高了在水性缓冲液中的溶解度。通过解析 USP30ch3与 NK036 复合物的晶体结构，研究人员发现 NK036 与 USP30 的结合涉及多个区域的相互作用。其苯磺酰胺部分延伸到一个由化合物诱导的 USP30 开关环构象形成的隐蔽口袋中，这种结合模式通过多种极性和疏水相互作用实现，解释了抑制剂的高效性和特异性 。
进一步研究发现，USP30 结合 NK036 后的抑制机制与开关环的构象可塑性以及 Leu73 口袋的结合有关。与 USP30 - Ub - PA 复合物结构对比显示，NK036 的结合导致开关环发生大的构象变化，使其 N - 叔丁基 - 苯磺酰胺基团能够深入拇指亚结构域内的隐蔽口袋。同时，NK036 的氟苯甲酰基占据了识别泛素 Leu73 侧链的口袋，阻止了泛素的结合，从而抑制了 USP30 的活性。
研究人员还揭示了 USP30 特异性抑制的分子基础。通过对结合位点的分析，发现 Leu328 和 Phe453 这两个在人类 USP 家族中 USP30 特有的残基，位于配体结合位点的中心，是苯磺酰胺类抑制剂特异性抑制 USP30 的关键因素。实验表明，将 Phe453 突变为典型的酪氨酸后，NK036 的抑制效力显著降低，且突变蛋白在热迁移实验中被 NK036 稳定化的程度也明显减弱。在细胞实验中，过表达携带这些突变的 USP30 蛋白，对 NK036 的抑制作用表现出抗性，进一步验证了这些残基在特异性抑制中的重要性 。
最后，研究人员对 NK036 与其他 USP DUB 抑制剂的结合模式进行比较，发现 NK036 以独特的方式结合到 DUB 的配体结合热点（Leu73 口袋），并通过苯磺酰胺部分延伸到隐蔽口袋中。基于此，他们提出了一个针对特异性 USP DUB 抑制的概念框架，即通过结合 Leu73 泛素结合位点的共同配体结合热点和多样化的化合物延伸来实现特异性抑制。
在这项研究中，研究人员通过嵌合蛋白工程解析了 USP30 与抑制剂的晶体结构，揭示了小分子特异性抑制 USP30 的分子机制。这一研究成果为基于结构的药物设计提供了重要依据，有助于开发更有效的治疗帕金森病及其他相关疾病的药物。同时，该研究提出的概念框架为其他 DUB 抑制剂的研发提供了新思路，推动了去泛素化酶抑制剂领域的发展，在神经退行性疾病治疗研究方面具有重要的意义 。
