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新冠疫情肆虐，现有疫苗存在局限。研究人员以大肠杆菌 Nissle 1917（EcN）为对象，开展其表达新冠病毒刺突蛋白受体结合域（RBD）的研究。结果显示 EcN 无需密码子优化即可高效表达 RBD，这为新冠疫苗开发提供新方向。
新冠疫情在全球范围内的爆发，给人类健康和社会经济带来了沉重打击。尽管众多新冠疫苗迅速研发并投入使用，在一定程度上控制了疫情的发展，但现有疫苗仍存在诸多问题。比如，部分疫苗使用新冠病毒刺突蛋白（S 蛋白）作为免疫原，可能引发个体的非预期免疫反应，导致全身炎症和组织损伤。而且，在异源系统中生产 S 蛋白面临诸多挑战，生产过程复杂，成本高昂，难以满足大规模生产的需求。此外，疫苗的稳定性、运输和储存条件等问题，在偏远和资源有限地区也限制了疫苗的广泛分发和使用 。因此，开发更高效、更安全、更易于生产和分发的新冠疫苗迫在眉睫。
在此背景下，来自印度的研究人员开展了一项关于利用大肠杆菌 Nissle 1917（EcN）表达新冠病毒刺突蛋白受体结合域（RBD）的研究。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为新冠疫苗的研发开辟了新的道路。
研究人员采用了多种关键技术方法来开展此项研究。在菌株构建方面，通过 Gibson 组装法构建含有 Lpp-OmpA-RBD 融合基因的质粒，并将其转化到不同大肠杆菌菌株中。利用 SDS-PAGE 和 Western blot 分析检测蛋白表达情况；通过细胞分馏技术分离不同细胞组分，确定 RBD 的表达位置；运用超速离心法分离外膜囊泡（OMVs），并借助动态光散射（DLS）方法和免疫细胞化学技术对其进行表征和分析。
构建含有 Lpp-OmpA-RBD 融合基因的克隆
研究人员将编码 Lpp 蛋白 N 端 30 个氨基酸和 OmpA 蛋白 C 端 113 个氨基酸的基因片段融合，以 pKB225 为亲本载体，通过 Gibson 组装法将未经密码子优化的 SARS-CoV-2 刺突蛋白 RBD 编码基因插入到 Lpp-OmpA 融合基因的 C 端，构建出 Lpp-OmpA-RBD 融合质粒 pRBD。经 PCR 验证，成功获得含有目的基因的克隆。
EcN 的密码子使用模式与传统大肠杆菌表达系统不同
研究人员通过生物信息学工具分析发现，用于本研究的 RBD 编码 DNA 片段中，有超过 50 个密码子在 DH5α/BL21 中的使用频率低于 10，但在 EcN 中的使用频率较高。将 pRBD 分别转化到 EcN、Sixpack（一种含有对应稀有密码子 tRNA 基因的 BL21 衍生物）和 DH5α 中，SDS-PAGE 分析结果显示，Sixpack 和 EcN 诱导样品中出现了与 Lpp-OmpA-RBD 融合蛋白大小相符的条带，而 DH5α 中未出现，表明 EcN 的密码子使用模式与其他传统大肠杆菌菌株不同，能够有效翻译天然 RBD 片段。
SARS-CoV-2 病毒 RBD 在 EcN 的外膜部分表达
通过细胞分馏和超速离心，研究人员对携带 pRBD 的 EcN、Sixpack 和 DH5α 菌株进行处理，分离出不同细胞组分。SDS-PAGE 和 Western blot 分析结果表明，Sixpack 和 EcN 诱导样品的外膜部分出现了与 Lpp-OmpA-RBD 融合蛋白大小相符的条带，而 DH5α 外膜部分未出现该条带，证实了 SARS-CoV-2 病毒 RBD 在 EcN 的外膜部分高效表达。
EcN 和 Sixpack 外膜囊泡的表征
研究人员从诱导后的 EcN/pRBD 和 Sixpack/pRBD 菌株中分离 OMVs。DLS 分析显示，Sixpack 产生的 OMVs 大小约为 300nm，EcN 产生的 OMVs 约为 175nm，EcN 产生的 OMVs 相对较小。通过 Bradford 分析间接定量 OMVs 中的总蛋白浓度，发现 Sixpack 的 OMV 样品中总蛋白浓度约为 20μg/μl，EcN 的约为 5μg/μl，这可能与 OMVs 大小差异或 EcN 较低的囊泡形成水平有关。
EcN 和 Sixpack 的 OMVs 展示病毒 RBD
Western blot 分析表明，从 EcN/pRBD 和 Sixpack/pRBD 菌株中提取的 OMVs 样品出现了与 Lpp-OmpA-RBD 融合蛋白大小相符的条带，而不含 pRBD 质粒的菌株提取的 OMVs 中未出现该条带，证实了 OMVs 中存在病毒 RBD。免疫细胞化学实验中，未对 OMVs 进行透化处理，结果显示含有 pRBD 质粒的 EcN 和 Sixpack 的 OMVs 呈现荧光聚集，而不含 pRBD 质粒的则无荧光，表明融合蛋白确实展示在 OMVs 表面。
研究结论表明，EcN 能够无需密码子优化，高效表达 SARS-CoV-2 的天然 RBD 片段，且表达的 RBD 定位于 EcN 的外膜，并可展示在 OMVs 表面。这一发现意义重大，EcN 作为一种广泛应用的益生菌，具有良好的安全性，其独特的密码子使用模式使其成为表达异源蛋白的潜在优质平台。基于 EcN 的 OMVs 有望开发为新型新冠疫苗，为全球抗击新冠疫情提供新的选择。同时，该研究也为其他基于 EcN 的生物制药应用奠定了基础，拓宽了其在生物医学领域的应用前景。
