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为探究人冠状病毒 HKU1 碳水化合物结合特异性及结合碳水化合物后的构象变化机制，研究人员解析其刺突蛋白结构。结果发现其单体有四种构象状态，六氨基酸插入决定对特定糖脂的特异性。这为理解病毒感染机制提供依据。
在病毒的神秘世界里，冠状病毒一直备受关注。四种季节性冠状病毒能引发人类呼吸道感染，其中人冠状病毒 HKU1（HCoV-HKU1）和 HCoV-OC43 同属 β 冠状病毒的 Embecovirus 亚属，它们利用碳水化合物作为受体，尤其是 9-O - 乙酰化 N - 乙酰神经氨酸（Neu5,9Ac
2） 。HKU1 还可使用跨膜丝氨酸蛋白酶 2（TMPRSS2）作为受体，然而，其碳水化合物结合特异性的基础以及碳水化合物结合促进的构象变化尚未完全明晰。为了深入了解这些关键问题，来自加拿大多伦多大学等机构的研究人员展开了深入研究。这项研究成果发表在《Nature Communications》上，为揭开 HKU1 感染的神秘面纱提供了重要线索。
研究人员运用了多种关键技术方法。在蛋白质和碳水化合物的制备方面，通过在 HEK293F 细胞中表达并纯化 HKU1 刺突蛋白及其 D1 结构域，同时利用酶促反应合成并纯化多种含 9-O - 乙酰化唾液酸的聚糖。在检测蛋白与聚糖的结合亲和力上，采用表面等离子共振（SPR）和生物膜干涉（BLI）技术 。为解析蛋白结构，使用冷冻电镜（cryo-EM）技术收集数据，并通过一系列数据处理和分析流程获得高分辨率的蛋白结构模型。
在研究结果部分：
- HKU1 刺突蛋白的多种构象状态：通过对 apo 和 9OAc-GD3ap样本的冷冻电镜数据集分析，发现碳水化合物结合促进 D2 结构域向上构象转变。进一步研究识别出 HKU1 单体存在四种离散构象状态：Down（D）、DownAlt（DAlt）、Active（A）和 Up（U） 。在 apo 数据集中观察到 Down、Active 和 Up 状态的混合单体，而 9OAc-GD3 复合物数据集中则包含所有可能的构象组合。
- HKU1 对 9-O - 乙酰化 GD3 神经节苷脂的识别机制：9OAc-GD3ap数据集详细描述了不同状态下 D1 结构域与碳水化合物的结合情况。蛋白仅与 9OAc-GD3 四糖的 9-O - 乙酰化二唾液酸部分相互作用，且该结合位点的残基在 Embecovirus 中高度保守。研究还发现，HKU1 特有的六氨基酸插入（insert-2）与 α2 - 3 连接的唾液酸部分相互作用，对 9OAc-GD3 的结合亲和力至关重要，突变实验进一步证实了这一点。此外，HKU1 对含 9-O - 乙酰化 α2 - 8 连接二唾液酸部分的糖脂具有较高亲和力，而对其他相关聚糖亲和力较弱。
- 混合单体的结构与构象变化关系：分析混合单体在 Down 状态的结构，发现其 D1、D2 和 D3 结构域形成紧密排列，能够介导相关的构象变化。从 Down 状态转变为 Active 状态，再到 Up 状态，伴随着 D1 主结构域和 D2 结构域的协同旋转，且这种转变能力是 HKU1 刺突蛋白的内在特性。
- 构象转换的分子机制：研究发现，D1 结构域中一段被称为 “构象中继” 的多肽片段（残基 26 - 40）在定义离散状态中起关键作用。从 Down 状态到 Active 状态的转变过程中，碳水化合物结合位点完全结构化，构象中继发生两残基的移位，形成 Active - bulge，导致 D1 主结构域旋转和 D2 结构域取向改变。而从 Active 状态到 Up 状态的转变过程中，构象中继不再发生变化。
- DownAlt状态的特殊作用：DownAlt状态仅存在于 9OAc-GD3ap数据集中，该状态下碳水化合物结合位点虽已完全结构化，但 D2 结构域仍处于向下构象，构象中继的部分残基无序，可能储存碳水化合物结合能量，用于后续向 Active 状态的转变。
- 特定序列对构象转变的影响：对构象中继中 TVPR 序列进行突变研究，发现突变后碳水化合物结合无法促进 D2 结构域向上构象转变，表明该序列在稳定构象中继和促进碳水化合物结合位点结构化导致的移位中起关键作用。
在研究结论和讨论部分，该研究揭示了 9-O - 乙酰化 GD3 聚糖与 HKU1-A 刺突蛋白结合促进 D2 结构域向上构象转变的复杂机制，这支持了碳水化合物受体结合促进蛋白受体结合的模型。研究还表明，不同 HKU1 基因型在碳水化合物结合位点结构和亲和力上可能存在差异，而 insert-2 是决定 HKU1 对含 9-O - 乙酰化 α2 - 8 连接二唾液酸部分糖脂特异性的关键因素，同时有助于减少与诱饵受体的相互作用。此外，碳水化合物结合并非简单地以开关方式导致向上构象转变，而是通过 Active 和 DownAlt状态实现精细调节，可能仅在特定膜环境中促进有效病毒进入或细胞 - 细胞融合。该研究为深入理解 Embecovirus 利用碳水化合物和蛋白受体介导的膜融合机制提供了重要依据，对研究冠状病毒感染和发病机制具有重要意义，也为开发针对 HKU1 的防治策略提供了潜在靶点和理论基础。
