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在植物研究中，昼夜节律对植物生长发育至关重要，但单细胞水平的昼夜基因表达情况不明。研究人员运用时间延时单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）研究拟南芥昼夜节律。发现细胞簇节律特征，鉴定出 ABF1 等调控因子，为植物昼夜节律研究提供资源。
在神奇的植物世界里，昼夜交替如同大自然的指挥棒，深刻影响着植物的生长、发育和适应环境的能力。昼夜节律（circadian rhythm）作为植物内部的 “生物钟”，协调着植物的各种生理过程，使其能与外界环境的 24 小时循环同步。这一生物钟由核心时钟基因形成的转录 - 翻译反馈环（transcriptional-translational feedback loops，TTFLs）驱动，从黎明到深夜调节基因表达，进而控制植物的新陈代谢和生长。
在过去，虽然科学家们利用生物发光追踪（如 promoter:LUC）和实时定量 PCR（qRT-PCR）等技术，对植物昼夜节律进行了广泛研究，但这些方法无法揭示单个细胞层面的昼夜节律差异。近年来兴起的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）技术，为研究细胞异质性带来了新的视角，不过在植物研究中，由于植物细胞被坚硬的细胞壁包裹，传统获取单细胞的原生质体过程耗时较长，难以捕捉昼夜调节的瞬时转录变化，限制了其在植物短间隔时间序列分析中的应用。因此，绘制植物单细胞水平的昼夜基因表达图谱，深入了解植物昼夜节律的细胞特异性机制，成为植物生物学领域亟待解决的重要问题。
为了攻克这些难题，深圳南方科技大学生命科学学院植物与食品科学研究所植物遗传工程与分子设计深圳市重点实验室等多家研究机构的研究人员展开了深入研究。他们运用时间延时单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）技术，对拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗进行研究。研究人员在 48 小时内每 4 小时、24 小时内每 2 小时收集一次拟南芥幼苗样本，分别获得了超过 77,142 个和 130,000 个细胞核的转录组数据。
研究人员用到的主要关键技术方法包括：首先是 snRNA-seq 技术，它能克服植物细胞壁的物理限制，获取高时间分辨率的单细胞转录组数据；其次是数据处理与分析技术，通过多种策略评估和消除样本批次效应，对数据进行聚类和注释，以确定细胞类型；最后，构建转基因植物并进行生物发光分析，验证基因的振荡模式和功能。
下面来看具体的研究结果：
- snRNA-seq 揭示拟南芥昼夜节律：通过 snRNA-seq 获得的 24 小时和 48 小时数据集都显示出明显的昼夜节律模式，相邻时间点的转录组相似性增加，且核心时钟基因的表达模式呈现出预期的振荡峰值，证实了该方法能有效捕捉时钟基因的动态变化。此外，研究人员评估了五种数据整合策略，最终选择了能在保留生物学特征和消除批次效应之间达到平衡的策略，对数据进行整合和聚类，成功鉴定出 40 个（48 小时数据集）和 27 个（24 小时数据集）不同的细胞簇，并注释了细胞类型12。
- 分析不同细胞类型的时钟基因表达：研究人员收集了已知的时钟调节基因，分析其在不同细胞类型中的节律性。发现约 40%（24 小时数据集）和 74%（48 小时数据集）的时钟调节基因在至少一个细胞簇中显示出转录节律性积累，且叶肉细胞等 shoot 细胞簇中的振荡基因数量较多。同时，还鉴定出了在所有细胞类型中稳定且高表达的基因，可作为标准化 qPCR 结果和 RNA-seq 实验的参考。比较核心时钟基因在不同细胞类型中的振荡模式，发现它们在不同数量的细胞簇中表现出不同的振荡模式，且存在相位和振幅的差异，这体现了不同细胞类型功能昼夜时钟的异质性34。
- 四种叶肉细胞类型表现出同步振荡：通过 S-MOD 方法分析不同细胞类型基因振荡的重叠情况，发现 shoot 和 root 细胞之间存在明显差异，shoot 内组织的振荡基因一致性较高。在 48 小时数据集中，四种叶肉细胞类型（clusters S0, S1, S2, and S7）的振荡基因具有较高的统计相关性，且存在相位滞后现象。在 24 小时数据集中，部分 shoot 细胞（如叶肉、增殖、分生组织和内胚层细胞）的振荡基因内容也有显著相关性56。
- snRNA-seq 鉴定不同细胞类型中昼夜时钟控制的基因：研究发现约 30%（48 小时数据集）和 61%（24 小时数据集）的基因仅在特定细胞簇中振荡，其中部分为簇特异性基因。对这些细胞类型特异性振荡基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）分析，发现不同细胞类型中振荡基因的功能存在差异。例如，叶肉细胞中与光刺激响应相关的基因富集，保卫细胞中与水杨酸（SA）响应相关的基因富集，韧皮部伴胞中与细胞对有机物质响应相关的基因富集等78。
- 数据驱动方法识别关键昼夜调节因子：研究发现许多核心时钟基因在多个细胞簇中振荡，且振荡基因并非都是高表达基因。通过对转录因子的排名分析，发现 ABRE 结合因子 1（ABF1）在调节昼夜节律中可能具有重要作用。过表达 ABF1 缩短了昼夜周期，证实了其作为新型昼夜调节因子的功能910。
研究结论和讨论部分指出，该研究通过时间序列高通量 snRNA-seq 数据，提供了植物单细胞水平昼夜基因表达谱的视角，揭示了植物昼夜时钟在细胞层面的复杂性，为理解植物昼夜节律的调控机制提供了重要依据。研究鉴定出的新型昼夜调节因子 ABF1，丰富了人们对植物昼夜节律调控网络的认识。此外，考虑到时钟组件在被子植物中的进化保守性，该研究的 snRNA-seq 数据和方法可用于其他植物物种，有助于进一步研究植物生物学中的昼夜节律，并可能为农业实践提供指导，如优化作物生长和提高产量。同时，研究人员创建的在线网站（
https://zhailab.bio.sustech.edu.cn/sc_circadian）提供了便捷的基因表达数据访问，为植物生物钟研究领域的科研人员提供了有价值的资源，促进了相关研究的进一步发展。总之，这项研究在植物生物钟研究领域取得了重要突破，为后续研究奠定了坚实基础。
