合成LPS模拟物通过独特结合模式激活TLR4/MD-2的结构解析及其免疫治疗应用

本研究针对天然LPS结构复杂、毒性高等问题，通过合成非还原性二糖骨架的脂质A模拟物（DLAMs），解析了其与人类和小鼠TLR4/MD-2复合物的6种冷冻电镜结构（2.2-3.1?），揭示了物种非依赖性TLR4激动活性的结构基础。该工作为开发高效TLR4靶向免疫疗法和佐剂提供了新策略。

　　

免疫系统如何识别病原体并触发防御反应？Toll样受体4（TLR4）与其辅助蛋白MD-2组成的复合物是关键“哨兵”，能够检测细菌脂多糖（LPS）等危险信号。然而，天然LPS作为TLR4的主要激动剂存在结构异质性、毒性强和物种特异性等缺陷，严重限制了其临床应用。如何设计安全高效的合成LPS替代物，成为免疫治疗领域的重要挑战。

韩国科学技术院（KAIST）和奥地利自然资源与生命科学大学的研究团队Yaoyao Fu、Hyojin Kim等人在《Nature Communications》发表研究，通过冷冻电镜技术解析了六种二聚体[TLR4/MD-2/配体]₂复合物的高分辨率结构（2.2-3.1?），揭示了合成脂质A模拟物（DLAMs）的独特激活机制。这项研究首次阐明αGlcN(1→1)αMan骨架的二糖脂质模拟物如何通过“分子桥”作用促进TLR4二聚化，为开发新一代免疫调节药物提供了精确蓝图。

研究采用冷冻电镜（分辨率达2.24?）、分子对接和细胞信号检测等关键技术，结合人/小鼠TLR4/MD-2蛋白表达纯化系统，以及人源单核细胞衍生的树突状细胞（moDCs）模型。通过比较三种不同磷酸化和酰化模式的DLAMs（DLAM5/DLAM3/DLAM1）结合特性，揭示了物种特异性识别的结构基础。

【物种非依赖性TLR4激活的结构基础】
冷冻电镜结构显示，最强效的pM级激动剂DLAM5在人和小鼠TLR4/MD-2中采用相同结合姿态：二糖骨架沿二聚化界面排列，GlcN连接的P4'磷酸基与hTLR4的K362或mTLR4的R337/K360形成离子键。暴露的R6'脂链通过F126^MD-2和F440*^TLR4*稳定在MD-2开口处，这种保守结合模式解释了其跨物种高效性。

【磷酸化模式决定激活效能】
单磷酸化的DLAM3在人和小鼠系统中呈现截然不同的结合方向：与人TLR4结合时P4'远离二聚界面，而与小鼠复合物结合时P4'直接接触R434*^mTLR4*。这种构象差异导致其活性降低1000倍（nM级），说明磷酸基数量和位置直接影响二聚化效率。

【双磷酸化DLAM1的物种特异性反转】
有趣的是，双磷酸化DLAM1在人系统中模拟天然LPS的“正向”结合，而在小鼠系统中呈现180°旋转的“反向”结合。尽管结合姿态相反，其纳摩尔级活性表明双磷酸基可通过不同空间配置实现等效激活，这为克服物种差异提供了新思路。

研究结论指出，DLAMs通过刚性二糖骨架和优化脂链分布实现三个关键功能：（1）作为分子桥连接两个TLR4/MD-2复合物；（2）磷酸基介导特异性离子相互作用；（3）暴露脂链稳定二聚界面。相比天然LPS受核心寡糖约束的单一结合模式，DLAMs展示了多维度可调控性——通过调整Man位点的酰化/磷酸化模式，可精确控制炎症因子释放谱（如DLAM5诱导IL-6达26 pM EC50）。

该研究不仅阐明了TLR4激活的“构象密码”，更建立了“结构-活性”定量关系模型。这些发现对阿尔茨海默病（通过TLR4激活清除β淀粉样蛋白）、肿瘤免疫治疗（增强肿瘤微环境免疫应答）等领域具有重要应用价值。团队设计的DLAM5因其pM级效价和物种普适性，已成为开发新型疫苗佐剂和免疫调节剂的理想候选分子。