Foxp3 重编程代谢：开启 CAR-T 细胞治疗肿瘤新篇章

这篇研究发现，在嵌合抗原受体 T（CAR-T）细胞中过表达 Foxp3，可通过与 Drp1 相互作用重编程代谢，降低有氧糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS），增强脂质代谢。CAR-TFoxp3细胞无免疫抑制功能，却能减少耗竭、增强抗肿瘤效果，为肿瘤免疫治疗带来新希望。

　　

研究背景

嵌合抗原受体 T（CAR-T）免疫疗法在血液癌症治疗中展现出一定成效，但在实体瘤治疗方面却存在明显不足，其有效性较低且治疗反应往往是短暂的。这主要是因为 CAR-T 细胞在肿瘤微环境（TME）中面临着营养匮乏的困境，同时持续受到肿瘤抗原的刺激，最终导致细胞耗竭以及 ATP 合成出现障碍，这一难题严重阻碍了 CAR-T 免疫疗法在实体瘤治疗中的应用。

不同类型的 T 细胞亚群在生理状态下，其代谢方式存在差异，并且在分化过程中 T 细胞会对代谢途径进行调整。比如，初始 T（Tn）淋巴细胞处于静息状态时，依靠氧化磷酸化（OXPHOS）维持自身存活；而在受到抗原刺激后，Tn 细胞会分化为效应 T 细胞（Teffs），此时代谢策略会从 OXPHOS 转变为有氧糖酵解，以此来执行效应功能。调节性 T 细胞（Tregs）作为 T 细胞的一个亚群，具有独特的代谢特征，表现为脂质代谢水平升高，而有氧糖酵解和 OXPHOS 水平降低。越来越多的证据表明，Tregs 这种独特的代谢模式有助于它们在由癌细胞高度增殖所营造的缺氧、酸性 TME 中实现长期存活和大量增殖。此外，Foxp3 被证实是 Treg 代谢的关键调节因子。然而，目前尚不清楚 Foxp3 能否在 Teffs，尤其是 CAR-T 细胞中过表达，进而改变其代谢特性，使其在 TME 中实现长期存活并发挥作用。

实验设计

在本研究中，研究人员构建了 CAR-T_Foxp3细胞，具体方法是将 Foxp3 与第三代 CAR 进行共表达，以此对 CAR-T 细胞的代谢进行重编程。研究人员从多个方面对 CAR-T_Foxp3细胞展开了深入探究，在体外实验中，分析其代谢特征、细胞毒性以及持久性，并排除其免疫抑制作用；在体内实验中，利用多种小鼠模型评估其抗肿瘤活性、免疫抑制情况以及在肿瘤再挑战模型中的表现。

实验结果

1. CAR-T_Foxp3细胞具有独特代谢特征：研究人员利用第三代 CAR，将来自健康供体的人类 T 淋巴细胞激活，分别感染 GPC3-CAR 生成常规 GPC3-CAR-T（CAR-T_Conv）细胞，以及感染 GPC3-CAR 和 Foxp3 生成 GPC3-CAR-T_Foxp3（CAR-T_Foxp3）细胞。通过测量代谢参数发现，CAR-T_Foxp3细胞在受到 GPC3 蛋白刺激后，其细胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR）均低于 CAR-T_Conv细胞。进一步研究发现，CAR-T_Foxp3细胞在 [U-C¹³]- 葡萄糖和 [U-C¹³]- 谷氨酰胺代谢通量方面也与 CAR-T_Conv细胞存在差异，产生的相关代谢产物减少，同时细胞内 ATP 水平较低，NAD/NADH 比值较高，这表明其糖酵解和 OXPHOS 均出现适度下调。此外，通过非靶向 LC-MS 筛选和脂质组学分析发现，CAR-T_Foxp3细胞中与脂质和氨基酸代谢途径相关的代谢物表达存在差异，甘油三酯水平显著升高，细胞内脂滴含量也明显增加，线粒体膜电位（MMP）和线粒体质量则有所降低。综合这些结果可以看出，CAR-T_Foxp3细胞的代谢特征与 Tregs 相似，但与 CAR-T_Conv细胞存在明显差异。
2. 代谢特征由 Foxp3 与 Drp1 结合决定：鉴于 CAR-T_Foxp3细胞线粒体相关指标的变化，研究人员对其代谢模式的成因展开研究。通过双分子荧光互补（BiFC）实验、谷胱甘肽 S - 转移酶（GST） pull-down 实验等多种实验方法证实，Foxp3 能够与动力相关蛋白 1（Drp1）相互作用，且二者在细胞质中存在共定位现象。进一步研究发现，Foxp3 不会影响 Drp1 的表达以及其在丝氨酸 637 位点的磷酸化，但会显著降低 Drp1 在丝氨酸 616 位点的磷酸化水平。通过构建不同的质粒进行实验表明，当删除 Foxp3 中 340 - 390 片段时，会破坏 Foxp3 与 Drp1 的相互作用，导致 CAR-T_Foxp3细胞的线粒体形态、数量以及代谢相关指标发生改变，这充分说明 CAR-T_Foxp3细胞的代谢重编程是由 Foxp3 与 Drp1 的结合所介导的。
3. CAR-T_Foxp3细胞不具备 Tregs 的染色质可及性和抑制功能：考虑到 Foxp3 在 Treg 发育和分化中的关键作用，研究人员对 CAR-T_Foxp3细胞是否会转化为 Tregs 进行了研究。通过对 Tregs、CAR-T_Conv和 CAR-T_Foxp3细胞进行染色质可及性分析发现，三者之间存在明显差异。CAR-T_Foxp3细胞与 Tregs 在染色质景观上存在根本区别，在 Tregs 中高度富集的一些与抑制功能相关的转录因子结合位点，在 CAR-T_Foxp3细胞中并未富集。此外，在分析 Treg 细胞相关标记物和细胞因子时发现，CAR-T_Foxp3细胞分泌的白细胞介素 - 10（IL-10）和转化生长因子 β（TGF-β）水平较低，细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4（CTLA-4）抑制受体的表达也较少，与 CAR-T_Conv细胞的表达水平相近。在共培养实验中，CAR-T_Foxp3细胞对常规 T（T_Conv）细胞增殖的抑制作用与 CAR-T_Conv细胞相似，几乎没有抑制效果。这些结果充分表明，CAR-T_Foxp3细胞在染色质景观和抑制功能方面与 Tregs 存在显著差异。
4. Foxp3 介导的代谢下调 CAR-T_Foxp3细胞耗竭相关抑制分子的表达：研究人员将 CAR-T_Foxp3和 CAR-T_Conv细胞与 GPC3⁺ Huh7 肿瘤细胞共同孵育 72 小时后发现，CAR-T_Foxp3细胞在激活标记物、表型标记物和关键转录因子的表达水平上与 CAR-T_Conv细胞存在差异，且在细胞毒性方面与 CAR-T_Conv细胞相当，但释放的细胞因子较少。同时，CAR-T_Foxp3细胞在受到 GPC3 肿瘤抗原刺激后，其程序性细胞死亡 - 1（PD-1）、淋巴细胞激活基因 - 3（LAG-3）和 T 细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域 - 3（TIM-3）等耗竭标记物的表达百分比明显降低。在进行多轮抗原刺激实验中，CAR-T_Foxp3细胞在第 12 天表现出耗竭分子减少和干细胞标记物增加的现象，而缺失 340 - 390 片段的 CAR-T_{Foxp3 (340–390)}细胞则未出现这种现象。此外，通过对细胞进行不同处理发现，Foxp3 与 Drp1 的相互作用以及代谢模式均与 CAR-T_Foxp3细胞耗竭标记物的下调有关。
5. CAR-T_Foxp3细胞在体内具有强大的抗肿瘤活性且耗竭标记物减少：在小鼠皮下异种移植肿瘤模型实验中，研究人员发现接受 CAR-T_Foxp3细胞治疗的小鼠肿瘤生长速度最慢。对肿瘤组织进行分析发现，CAR-T_Foxp3细胞中 CD28 表达明显增加，而 PD-1、LAG-3 和 TIM-3 等耗竭标记物显著减少。通过 RNA 测序（RNA-seq）分析进一步证实，CAR-T_Foxp3细胞处于较低的耗竭状态，且与 Tregs 在转录组水平上存在根本差异。在肿瘤再挑战模型实验中，CAR-T_Foxp3细胞在首次肿瘤清除后，表现出较高比例的初始 / 干细胞记忆 T（TN/TSCM）细胞和较低比例的终末效应记忆 T（TEMRA）细胞，在再次受到肿瘤挑战时，其肿瘤生长速度最慢。这充分表明 CAR-T_Foxp3细胞在体内具有强大的抗肿瘤活性，且能够维持较低水平的耗竭标记物。
6. CAR-T_Foxp3细胞在人源化 NSG 模型中获得强大抗肿瘤活性且无免疫抑制：为了评估 CAR-T_Foxp3细胞在免疫健全模型中的抗肿瘤效果以及对其他免疫细胞的影响，研究人员构建了人免疫系统重建（人源化）的 NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^em1Smoc（NSG）小鼠模型。在该模型中，CAR-T_Foxp3细胞能够有效抑制肿瘤生长，部分小鼠实现完全缓解。对肿瘤浸润的 CAR-T 细胞和其他免疫细胞进行分析发现，CAR-T_Foxp3细胞的耗竭相关抑制分子水平较低，且肿瘤浸润的 CD4⁺ T 细胞数量较多。同时，在该模型中，CAR-T_Foxp3细胞治疗组的脾脏重量和重要器官与 CAR-T_Conv细胞治疗组相比，没有显著差异，且外周血中细胞因子的分泌情况表明，CAR-T_Foxp3细胞治疗组的细胞因子风暴现象有所减轻。这说明 CAR-T_Foxp3细胞在人源化 NSG 模型中不仅具有强大的抗肿瘤活性，而且不会引起免疫抑制，安全性较高。

研究讨论

CAR-T 细胞在 TME 中容易发生耗竭，这是 CAR-T 细胞治疗面临的主要障碍之一。而 Tregs 能够在实体肿瘤中生存、增殖并促进肿瘤进展，其代谢优势起到了重要作用。本研究表明，在 CAR-T 细胞中过表达 Foxp3 是一种有效的代谢干预策略，它通过与 Drp1 的相互作用重编程 CAR-T 细胞的代谢，避免了肿瘤浸润 CAR-T 细胞的耗竭，增强了其细胞毒性和长期免疫监视功能。

尽管 Tregs 的代谢途径存在一定争议，但本研究发现 Foxp3 能够与 Drp1 相互作用，影响线粒体的功能和形态。Foxp3 可能通过限制线粒体裂变，降低线粒体数量、质量和 MMP，进而减少 CAR-T_Foxp3细胞中的 OXPHOS。同时，CAR-T_Foxp3细胞增加的脂质代谢有助于其更好地适应缺氧的 TME，并抑制耗竭相关抑制分子的表达。

此外，研究还发现过表达 Foxp3 在 CAR-T 细胞中仅改变了代谢途径，并未影响 Treg 抑制功能相关基因的表达和染色质可及性，且通过体内外功能实验排除了 CAR-T_Foxp3细胞的抑制作用。这可能是因为 Foxp3 单独不足以调节完整的 Treg 转录组，其直接结合的与 Treg 抑制活性相关的基因仅约 10% 。

总体而言，本研究强调了 Foxp3 重编程代谢在提高 CAR-T 细胞抗肿瘤疗效方面的潜在应用前景，为临床免疫治疗提供了新的思路。然而，CAR-T_Foxp3细胞在临床试验中的疗效和持久性仍需进一步研究。

研究局限

虽然本研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。首先，Foxp3 特异性降低 Drp1 在丝氨酸 616 位点磷酸化的精确机制尚未完全阐明。其次，CAR-T_Foxp3细胞与天然 Tregs 在功能上存在差异，其潜在的调控机制需要进一步深入探索。最后，虽然 Foxp3 在 CAR-T_Foxp3细胞中主要定位于细胞质，但核内 Foxp3 的功能，尤其是其在转录调控中的作用，目前还不明确。