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本文通过整合基于 APEX2 的邻近标记与泛素残基基序（K-ε-GG）富集技术，成功鉴定了去泛素化酶（DUBs）USP30 的底物，包括已知的 TOMM20、FKBP8 和新发现的 LETM1，为研究泛素调节通路和相关疾病治疗提供了重要依据。
研究背景
泛素（Ub）在真核生物中高度保守，通过 E1、E2 和 E3 酶的级联反应与靶蛋白共价结合，形成的泛素化修饰在众多细胞功能中发挥关键作用 。去泛素化酶（DUBs）和 E3 连接酶是维持泛素稳态的重要酶类，它们的失衡与多种疾病相关，如癌症和神经退行性疾病。因此，鉴定 DUBs 的底物对于理解其生物学功能及探索潜在治疗靶点至关重要。
此前用于鉴定 E3 连接酶底物的方法，如融合技术（UBAITS、TULIP、TULIP2）、体外技术（E2-dID、正交 Ub 转移、微阵列测定）以及 UbPOD 和 BioE3 等，各有局限性，且都无法直接用于研究 DUBs 的底物。而基于 K-ε-GG 基序富集的方法虽可识别泛素化位点，但难以区分直接和间接的泛素化事件。近十年来发展的邻近标记技术，如 BioID 和 APEX，可用于识别蛋白质微环境中的蛋白质，但单独使用时也存在不足。
本研究选择抗坏血酸过氧化物酶 2（APEX2）作为邻近标记酶，因其生物素化反应迅速且不干扰赖氨酸残基的泛素化。同时，选择线粒体去泛素化酶 USP30 作为模型 DUB，因其在帕金森病等疾病的治疗中具有潜在药物靶点价值，且对其已有一定研究基础，便于对实验结果进行交叉验证。
实验方法
- 构建和优化实验系统：构建稳定表达 USP30-APEX2 融合蛋白的 HEK293 细胞系，使用低表达启动子（PGK）以控制融合蛋白的表达水平。通过多种实验方法对该系统进行优化，包括验证 USP30-APEX2 融合蛋白的活性和定位、优化 APEX2 生物素化标记效率、确定最佳的链霉亲和素磁珠用量以及优化实验条件以鉴定潜在的 USP30 底物。
- 进行近端泛素组学实验：对优化后的实验系统进行近端泛素组学实验，设置不同处理组，包括用羰基氰化物 3 - 氯苯基腙（CCCP）处理以激活 PINK1/Parkin S65 磷酸化泛素化途径，以及用化合物 39 抑制 USP30 活性。实验过程中，分别收集标记蛋白质组、邻近蛋白质组、正常蛋白质组、正常泛素组、标记泛素组和近端泛素组等样本进行后续分析。
- 样本分析与数据处理：对收集的样本进行液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）分析，通过特定软件（DIA-NN 1.8.1）进行数据处理和分析。包括对蛋白质和肽段的鉴定、定量，以及进行主成分分析、置换分析、基因集富集分析等，以确定差异表达的蛋白质和泛素化肽段，并评估实验结果的显著性。
- 验证潜在底物：对于鉴定出的潜在 USP30 底物，如 LETM1，通过抗体介导的邻近连接测定（PLA）、共定位实验、免疫共沉淀（coIP）等方法验证其与 USP30 的相互作用和邻近性。同时，通过 HA - 泛素拉下实验和串联泛素结合实体（TUBE）拉下实验验证其泛素化状态的变化。
- 线粒体形态分析：利用晶格光片显微镜对线粒体进行成像，分析 USP30 敲低对线粒体形态的影响。通过特定的图像处理和分析方法，测量线粒体的表面积、体积、表面积与体积比等参数，以评估线粒体形态的变化。
实验结果
- 优化实验系统：成功构建并优化了 USP30-APEX2 系统和近端泛素组学工作流程。确定了最佳的实验条件，如 5 mM 生物素用于高效蛋白质生物素化、1 mL 链霉亲和素磁珠 / 10 mg 输入蛋白用于捕获生物素化蛋白质、5×15 cm 培养皿的细胞作为最佳输入材料等。同时，确定了在实验中使用 10 μM CCCP 处理细胞 6 h，并添加 5 μM 化合物 39 用于抑制 USP30 活性的实验条件。
- 近端泛素组学分析：通过近端泛素组学实验，发现该方法能够富集线粒体相关蛋白，尤其是线粒体外膜（OMM）蛋白。在 USP30 抑制后，观察到泛素化肽段强度的显著变化，鉴定出多个潜在的 USP30 底物，包括 TOMM20、FKBP8、VDAC2、VDAC1 和 CISD1 等已知底物，以及新发现的底物 LETM1。
- 验证 LETM1 为 USP30 底物：通过多种实验方法验证了 LETM1 是 USP30 的相互作用蛋白和底物。PLA、共定位实验和 coIP 实验表明 LETM1 与 USP30 在空间上接近且存在物理相互作用。HA - 泛素拉下实验和 TUBE 拉下实验显示，在 USP30 抑制或敲低时，LETM1 的泛素化水平增加。
- USP30 对线粒体形态的影响：晶格光片显微镜分析结果显示，USP30 敲低导致线粒体形态发生微妙变化，表现为线粒体表面积与体积比略有增加，主要是由于体积的变化。这表明 USP30 可能在调节线粒体形态方面发挥作用，但目前尚不清楚这种作用是否依赖于 LETM1。
研究结论
本研究通过整合 APEX2 邻近标记和泛素组学富集技术，成功开发了一种近端泛素组学工作流程，用于鉴定 DUBs 的底物。以 USP30 为模型，该方法不仅识别出已知的底物，还发现了新的底物 LETM1，为深入理解 USP30 在调节线粒体自噬和维持线粒体稳态中的作用提供了重要线索。此外，该方法具有广泛的适用性，可用于其他 DUBs 底物的发现，为研究泛素调节通路和开发相关疾病的治疗策略提供了有力的工具。然而，本研究也存在一定的局限性，如 APEX2 标记依赖于诱饵蛋白的表达水平，可能导致背景信号增加；在功能研究方面，LETM1 去泛素化的功能相关性尚未完全明确，且所有实验均在 HEK293 细胞中进行，可能无法完全反映生理背景下的情况。未来的研究需要进一步优化实验方法，深入探讨 USP30 与底物之间的功能关系，并在更多的细胞类型和生理条件下进行验证。
