北美 2012 - 2023 年解脲脲原体分离株的抗菌药敏性及耐药遗传机制：守护健康的关键洞察

这篇研究分析了 415 株解脲脲原体（Ureaplasma）分离株的抗菌药敏性并探究耐药遗传机制。发现红霉素、四环素和左氧氟沙星对多数菌株仍有效，不过部分菌株存在耐药性。持续监测耐药性很重要，为临床治疗 Ureaplasma 感染提供关键依据。

　　

引言

解脲脲原体（Ureaplasma）可引发多种疾病，在成人中与非淋菌性尿道炎、子宫内膜炎、绒毛膜羊膜炎、自然流产、尿路结石等相关；在新生儿中，可导致早产、低出生体重、菌血症、脑膜炎和肺部感染 。在免疫抑制宿主中，还会引发全身感染，如低丙种球蛋白血症患者的关节感染，以及肺和肾移植受者的高氨血症。

大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类是治疗解脲脲原体感染的主要抗菌药物类别。然而，解脲脲原体对这些药物的获得性耐药及相关分子机制已有报道，这可能限制了它们在某些情况下的使用。大环内酯类耐药主要源于 23S rRNA、核糖体蛋白 L4 和 L22 的突变，这些突变干扰了大环内酯类与 50S 核糖体的结合，进而抑制蛋白质合成。解脲脲原体对四环素类自然耐药的唯一已知机制是由 tet (M) 介导，它能阻止药物与 30S 核糖体结合。氟喹诺酮类耐药则主要由 DNA 拓扑异构酶 IV（由 parC 和 parE 编码）和 DNA 促旋酶（由 gyrA 和 gyrB 编码）的喹诺酮耐药决定区域（QRDR）突变介导。

美国关于解脲脲原体的体外抗菌药敏数据极为有限。尽管有标准化方法测定解脲脲原体的最低抑菌浓度（MIC），但药敏数据匮乏，主要原因包括医生很少要求进行 MIC 检测、仅有少数参考实验室开展相关检测，且尚无 FDA 批准的用于解脲脲原体的商业 MIC 检测系统。

阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）诊断支原体实验室对来自美国和加拿大临床标本的解脲脲原体进行 MIC 检测。本研究总结了 2012 - 2023 年期间对多种标本来源的解脲脲原体分离株进行红霉素、四环素和左氧氟沙星 MIC 检测的结果，并确定了所有非敏感分离株的耐药机制。

材料和方法

1. 解脲脲原体标本和分离株：从实验室数据库中检索 2012 - 2023 年进行抗菌药敏试验（AST）的 415 株解脲脲原体临床分离株的 MIC 结果。原始标本来自成人和新生儿，包括尿液、宫颈 / 阴道、尿道、鼻咽、气管等多种样本，部分标本来源未明确。标本采集自美国 22 个州和加拿大 1 个省的医疗中心。多数情况下，未区分解脲脲原体（U. urealyticum）和微小脲原体（U. parvum）。所有临床分离株经去识别化处理，分配唯一实验室编号并储存。由于检测完成后无患者标识符，本研究不涉及人体研究，无需获取患者知情同意。
2. 抗菌药敏试验：购买红霉素、四环素和左氧氟沙星的试剂级粉末，按临床实验室标准协会（CLSI）指南制备和稀释抗菌药物储备液。在 UAB 用 CLSI 指定配方的 10B 肉汤测定 MIC，并依据 CLSI 指南进行解释。检测药物稀释范围为 0.008 - 256 μg/mL，以解脲脲原体美国典型培养物保藏中心（ATCC）33175 菌株作为质量控制。CLSI 规定的药敏判断断点为：红霉素敏感（S）≤8 μg/mL，耐药（R）≥16 μg/mL；四环素 S≤1 μg/mL，R≥2 μg/mL；左氧氟沙星 S≤2 μg/mL，R≥4 μg/mL。
3. DNA 分离：对 61 株对红霉素、四环素和 / 或左氧氟沙星耐药的分离株中的 55 株进行分子遗传学分析。分离株储存于 - 80°C，使用 TGuide Smart Universal DNA Kit 和 Tiangen TGuide S16 核酸提取仪从用于 MIC 测定的原始培养物中提取 DNA，按细菌样本标准操作流程进行，DNA 洗脱于 120 μL Buffer TB 中。
4. PCR 和测序：通过实时 PCR 测定耐药分离株的解脲脲原体种类。针对 U. parvum 和 U. urealyticum 分别设计引物 / 探针，靶向特定基因。使用 Roche LightCycler 480 II 和 LightCycler 480 Genotyping Master 进行实时 PCR。采用传统 PCR 扩增与耐药相关基因，引物见相关表格。对红霉素耐药基因，扩增 23S rRNA 基因、核糖体蛋白基因 rplD（L4）和 rplV（L22）全长；对四环素耐药基因，检测 tet (M)、tet (O)、tet (S) 和 tet (W) 的存在，并扩增 16S rRNA 基因全长；对左氧氟沙星耐药基因，扩增 gyrA、gyrB、parC 和 parE 基因的 QRDR 区域。若 Sanger 测序出现混合峰，通过额外 PCR 区分 U. urealyticum 分离株中的两个 parC/parE 操纵子。PCR 扩增产物在 UAB Heflin 基因组核心进行双向 Sanger 测序，用 CLC Main Workbench 24 分析序列，与 14 株 ATCC 参考菌株对应基因比较，确定耐药相关突变。以携带 tet (M) 序列且对四环素耐药的 U. urealyticum 血清型 9（ATCC 33175）作为 tet (M) 阳性对照。
5. 统计分析：使用 IBM SPSS 29.0 进行统计分析。对 MIC 分布进行正态性检验，采用独立样本 Kruskal - Wallis 检验比较不同年份的 MIC，用卡方检验并进行 Bonferroni 校正比较不同年份的耐药率。

结果

1. MIC 总结：红霉素、四环素和左氧氟沙星的 MIC 范围分别为 0.063 - 256、0.016 - 64 和 0.063 - 32 μg/mL，MIC₅₀分别为 2、0.25 和 1 μg/mL，MIC₉₀分别为 4、1 和 2 μg/mL。三种药物的 MIC 均呈非正态分布，向低敏感范围偏斜。共有 61 株（14.7%）分离株对一种或多种药物耐药，红霉素、四环素和左氧氟沙星的耐药率分别为 2.4%（10/415）、6.5%（27/413）和 6.7%（28/415），4 株（0.8%）分离株对两种药物耐药。在 12 年研究期间，总体耐药率在 7.0% - 34.8% 之间波动，各年份间无显著差异。红霉素和氟喹诺酮的耐药率无显著变化，而 2014 年四环素耐药率（30.4%）显著高于其他年份。
2. 耐药机制
   • 红霉素耐药机制：10 株对红霉素耐药（MIC≥16 μg/mL）的分离株中，7 株检测到与大环内酯类耐药相关的遗传改变。5 株分离株的 23S rRNA 基因 V 结构域存在 A2058G（大肠杆菌编号）突变，其中 4 株为单拷贝突变，1 株为双拷贝突变，这 5 株分离株红霉素 MIC 均高达 256 μg/mL。1 株 U. urealyticum 分离株的 23S rRNA 基因有插入突变，且 rplD 基因存在重复，MIC 也为 256 μg/mL。1 株 U. parvum 分离株的 rplD 基因有缺失突变，MIC 为 32 μg/mL。3 株 MIC 相对较低（16 或 32 μg/mL）的分离株未检测到已知的耐药相关遗传改变，其中 1 株有 T1598C 改变。10 株耐药分离株的 rplV 基因均未检测到非同义突变。
   • 四环素耐药机制：55 株耐药分离株中有 23 株四环素 MIC≥2 μg/mL 被判定为耐药。所有四环素 MIC≥4 μg/mL 的 6 株分离株均检测到 tet (M) 转座子，但在 17 株 MIC 为 2 μg/mL 的分离株中，仅 6 株（35.3%）检测到 tet (M)。在 32 株四环素敏感分离株中，2 株 MIC<1 μg/mL 的分离株也检测到 tet (M)。14 条 Tet (M) 序列可分为两个主要亚组，8 条（I 组）与参考菌株 ATCC 33175 的 Tet (M) 序列聚为一组。序列类型与 MIC 值无相关性。所有 55 株耐药分离株中均未检测到 tet (O)、tet (S) 或 tet (W) 序列，23 株耐药分离株中也未发现已知的与四环素耐药相关的 16S rRNA 突变，但在 3 株 MIC = 2 μg/mL 的分离株中发现了远离已知四环素结合位点的 16S rRNA 序列变异，其在四环素耐药中的作用有待进一步研究。
   • 左氧氟沙星耐药机制：26 株 MIC≥4 μg/mL 的分离株被判定为左氧氟沙星耐药。其中，20 株分离株的 parC 基因存在 C248T（S83L）突变，3 株存在 G259A（E87K）突变。4 株具有 ParC S83L 突变的分离株在 gyrB 基因有额外突变，且左氧氟沙星 MIC 较高（≥16 μg/mL）。2 株 MIC 为 4 μg/mL 的分离株仅有 parE 基因单突变。1 株 U. urealyticum 分离株（65524）的 gyrB、parC 和 parE 基因有多个突变，但均不在 QRDR 区域，且该分离株还携带质粒介导的喹诺酮耐药决定因子，同时对四环素耐药但未明确耐药机制。26 株分离株中均未检测到 QRDR gyrA 突变。
   • 多重耐药情况：55 株进行基因评估的分离株中，4 株对两种药物耐药。如 U. urealyticum 分离株（90648）对红霉素（MIC = 256 μg/mL）和左氧氟沙星（MIC = 16 μg/mL）高度耐药，是由于 23S rRNA（A2058G）、ParC（S83L）和 GyrB（E482G）存在多个突变。
   
   

讨论

本研究是美国迄今对不同地理区域解脲脲原体临床分离株进行的最大规模体外药敏调查，并探究了相关耐药机制。超过 85% 的临床分离株对三种测试药物均敏感，仅 1.0% 对多种药物耐药。多数耐药分离株检测到已知的耐药相关分子机制。

与其他研究相比，本研究结果与部分研究相似，如 Fernandez 等人报道的左氧氟沙星耐药率与本研究相近，但在红霉素和四环素耐药率上存在差异。不同研究结果的差异可能与研究方法、标本来源和地区差异等有关。部分研究使用不符合 CLSI 方法的商业 MIC 试剂盒，可能高估耐药率，使其结果无法与本研究直接比较。

关于 tet (M) 与四环素耐药的关系，研究发现 tet (M) 在不同 MIC 值的分离株中分布存在差异。仅检测 tet (M) 不能准确判断四环素耐药情况，实际 MIC 测定至关重要。此外，解脲脲原体两种菌型与 tet (M) 序列存在及四环素敏感性的相关性值得进一步研究，也可考虑提高四环素耐药判断断点。

本研究进一步证实了 23S rRNA 基因 A2058G 突变对红霉素耐药的重要作用，核糖体蛋白突变导致相对低水平耐药。四环素耐药机制中，tet (M) 可解释高 MIC 耐药，但低 MIC 耐药情况存在矛盾，可能与 tet (M) 表达调控机制复杂有关。氟喹诺酮耐药主要由 ParC 亚基突变引起，其他亚基突变可增强耐药性。

部分分离株存在耐药但缺乏已知分子机制，可能存在其他耐药机制，如固有主动外排或移动元件携带的耐药基因，分析全基因组序列可能揭示这些机制。此外，本研究无法确定 61 株耐药分离株的耐药是否由抗菌药物选择压力或宿主免疫状态驱动。

总体而言，过去十年美国和欧洲多数遵循 CLSI 指南的解脲脲原体体外药敏研究表明，对常用抗菌药物的耐药率仍相对较低，大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类药物对解脲脲原体感染仍可能有效。然而，使用多西环素进行暴露后预防可能增加解脲脲原体对四环素类药物的耐药性。因此，持续监测抗菌药物耐药性十分必要，对于免疫抑制宿主或一线药物治疗失败的情况，建议进行体外药敏试验。