揭秘白色念珠菌奥秘：PI (4,5) P2与 Rho1p 调控胞质分裂及棘白菌素应答机制

本文聚焦白色念珠菌（Candida albicans），发现磷脂酰肌醇 -（4,5）- 二磷酸（PI (4,5) P2）和活性 Rho1p 的水平及分布调控，对其胞质分裂时空正确性和棘白菌素应答至关重要，为抗真菌研究提供新视角。

　　

引言

白色念珠菌（Candida albicans）引发的念珠菌感染危害严重，侵袭性念珠菌病（IC）每年影响全球 150 万人，致死近 100 万 。棘白菌素是治疗白色念珠菌感染的常用药物，通过抑制 1,3-β-D - 葡聚糖合酶破坏细胞壁发挥杀菌作用。

白色念珠菌的细胞壁和质膜在 IC 发病机制和棘白菌素敏感性中意义重大。PI (4,5) P₂定位于质膜胞质层，可与多种蛋白相互作用。此前研究发现，白色念珠菌暴露于棘白菌素卡泊芬净后，PI (4,5) P₂水平迅速上升且发生错误定位，同时细胞出现异常宽的芽颈 。并且，Irs4p 与 Inp51p 相互作用调控 PI (4,5) P₂水平，缺失IRS4或INP51基因的突变株对卡泊芬净高度敏感，毒力减弱。这些前期研究表明 PI (4,5) P₂-Septins 调控对棘白菌素应答、细胞壁完整性和白色念珠菌毒力至关重要，也暗示 PI (4,5) P₂与胞质分裂可能存在联系。虽然 PI (4,5) P₂在多种细胞功能中作用已被证实，但在胞质分裂中的作用研究较少。本研究首次有力证明 PI (4,5) P₂在白色念珠菌胞质分裂中的作用及对棘白菌素应答的重要性。

材料和方法

1. 菌株、生长条件、PCR 和亚克隆：研究使用多种白色念珠菌菌株，在酵母提取物 - 蛋白胨 - 葡萄糖（YPD）或合成限定（SD）培养基中 30°C 培养。PCR 采用高保真聚合酶，根据片段长度选择合适的酶。通过一系列操作进行嵌合蛋白融合和亚克隆，构建带有荧光标签的质粒，用于后续实验。
2. 转化：制备用于转化的 DNA，可通过酶切质粒纯化目的条带或 PCR 扩增整个盒式结构。采用电穿孔法转化白色念珠菌，在含 200 μg/mL 诺尔丝菌素的 YPD 平板上筛选转化子，通过显微镜观察和 PCR 筛选阳性转化子。
3. 活细胞成像：白色念珠菌在 YPD 培养基中过夜培养，次日转接新鲜培养基培养 3 - 4 小时。将细胞悬液滴在预处理的玻璃底培养皿上，固定细胞后进行洗涤，加入含或不含卡泊芬净的新鲜 YPD 培养基，在显微镜加热台上使用尼康 A1 共聚焦显微镜进行成像，用 NIS Elements 软件采集数据。
4. 活性 Rho1 的下拉实验：将RHO1与 13xcMyc 标签融合，构建载体替换天然基因。转化细胞后经 PCR 筛选正确整合的转化子，用 western blot 验证标签蛋白表达和大小。同时，将 PKC1 的 Rho1 结合域（PKC-RBD）与 CaGFP 融合并转化细胞共表达。细胞培养后裂解，提取蛋白，用 GFP-Trap Agarose 试剂盒拉下与 PKC-RBD-CaGFP 相互作用的活性 Rho1-13xMyc，再用 western blot 检测活性 Rho1p。

结果

1. PI(4,5)P₂斑块与胞质分裂在时空上相关：利用表达与 CaGFP 融合的普列克底物蛋白同源（PH）结构域的inp51和irs4突变株进行活细胞成像。PH 结构域可特异性结合 PI (4,5) P₂，约 50% 的细胞出现 PI (4,5) P₂斑块。研究发现，83% 的斑块出现在胞质分裂期间，84% 靠近胞质分裂位点，仅 12% 与胞质分裂时空均无关联，这表明异常 PI (4,5) P₂斑块与胞质分裂在时空上紧密相关。
2. Act1p 和 Myo1p 与异常 PI (4,5) P₂斑块共定位：Act1p 和 Myo1p 是肌动球蛋白的主要成分，在胞质分裂中起关键作用。在突变株中，分别共表达 CaACT1-CaRFP 和 CaMYO1-CaRFP 与 CaPHx2-CaGFP。结果显示，野生型细胞中 Act1p 定位于皮质肌动蛋白斑块，而突变株中 Act1p 错误定位并与异常 PI (4,5) P₂斑块共定位；野生型细胞中 Myo1p 在细胞周期中有特定定位变化，突变株中 Myo1p 在胞质分裂时错误定位并与异常 PI (4,5) P₂斑块共定位，表明肌动球蛋白的关键成分与 PI (4,5) P₂斑块存在错误定位关系。
3. 活性 Rho1p 错误定位于异常 PI (4,5) P₂斑块，且在irs4或inp51突变细胞中激活改变：在酿酒酵母中，Rho1p 参与细胞极化、肌动蛋白组织和细胞壁合成等过程。本研究用融合 CaGFP 的 PKC1p-RBD 作为活性 Rho1 的报告基因。野生型细胞中，活性 Rho1p 在细胞周边有特定分布模式，且在胞质分裂时高度定位于细胞分裂位点。在irs4或inp51突变株中，除野生型分布外，活性 Rho1p 还异常定位于 PI (4,5) P₂斑块，且多发生在胞质分裂末期。此外，通过下拉实验和 western blot 定量分析发现，突变株在稳定期 Rho1p 激活不足，在早期指数生长期过度激活，说明突变株中 PI (4,5) P₂定位和水平的破坏伴随着 Rho1p 调控和活性形式定位的紊乱。
4. 白色念珠菌野生型细胞暴露于卡泊芬净时表现出与 PI (4,5) P₂相关的类似缺陷：前期研究表明，野生型白色念珠菌暴露于卡泊芬净后，PI (4,5) P₂会迅速错误定位且水平升高。本研究中，野生型细胞共表达 CaPHx2-CaGFP 和 ACT1-CaRFP 或 MYO1-CaRFP，暴露于 4×MIC 卡泊芬净后，Act1p 和 Myo1p 均与 PI (4,5) P₂发生错误定位，且细胞出现异常，如较宽的母 - 子芽颈。同时，活性 Rho1p 也与 PI (4,5) P₂共错误定位。这些现象与INP51或IRS4缺失突变株中的情况相似，但在卡泊芬净处理的野生型细胞中更具动态性和短暂性。

讨论

此前研究发现，白色念珠菌暴露于卡泊芬净后，PI (4,5) P₂水平升高，质膜出现类似隔膜的内陷，且伴有卡泊芬净的杀菌活性和反常生长现象，同时 PKC-Mkc1 细胞壁完整性通路激活程度与药物抑制生长程度相关，暗示卡泊芬净暴露可能与胞质分裂紊乱有关。本研究进一步将 PI (4,5) P₂调控与胞质分裂直接联系起来，表明 PI (4,5) P₂失调和胞质分裂紊乱是白色念珠菌对卡泊芬净的自然应答的一部分。

PI(4,5)P₂在真核生物中功能多样，参与离子通道调节、肌动蛋白细胞骨架重塑等过程。在多种生物中，PI (4,5) P₂与胞质分裂密切相关，如在裂殖酵母、果蝇和哺乳动物细胞中都发挥着重要作用。本研究首次在白色念珠菌中探索了 PI (4,5) P₂、Rho1p、肌动球蛋白环和胞质分裂之间的关系。PI (4,5) P₂可与 Septins、Act1p、Myo1p 和 Rho1p 相互作用，其在分裂位点的浓度有助于肌动球蛋白环结构成分锚定到质膜，对胞质分裂的时空正确执行至关重要。

棘白菌素类药物卡泊芬净通过抑制 β - 1,3 - 葡聚糖合酶影响细胞壁合成，但它如何升高 PI (4,5) P₂水平并导致其错误定位尚不清楚。可能与 Rho GTPase RHO1、其激活剂 ROM2 有关，也可能是细胞壁应激的继发效应或对 PI (4,5) P₂合成或降解酶的直接作用。PI (4,5) P₂失调会影响相关蛋白，最终导致胞质分裂缺陷。本研究结果提示，由INP51编码的 PI (4,5) P₂ 5 - 磷酸酶及其相互作用伙伴 Irs4p 在有丝分裂末期细胞最终分裂时可能起关键作用，异常 PI (4,5) P₂斑块可能是不完全胞质分裂的残余。同时，PI (4,5) P₂、胞质分裂和细胞壁完整性通路应答可能是正常保护性应答的过度表达，受 PI (4,5) P₂与 Rho1p 相互作用的调控。