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本文聚焦产 KPC-2 的肺炎克雷伯菌，研究 KPC-14 中 ΔG242-T243 双缺失对头孢他啶 - 阿维巴坦（CZA）和亚胺培南 - 瑞来巴坦（IMR）疗效的影响。发现该缺失使 CZA 疗效降低，IMR 却能恢复菌株敏感性，为理解耐药机制和优化治疗提供依据。
引言
肺炎克雷伯菌产生的 KPC-2 是一种广泛传播的丝氨酸碳青霉烯酶，对临床治疗构成严重威胁。β- 内酰胺 - 二氮杂双环辛烷抑制剂（DBOs）组合，如头孢他啶 - 阿维巴坦（CZA）和亚胺培南 - 瑞来巴坦（IMR），在治疗产 KPC-2 菌株感染方面有一定成效。阿维巴坦（AVI）和瑞来巴坦（REL）可逆且高效抑制 KPC-2 的机制已有所研究，但 CZA 耐药菌株不断出现，与 KPC β- 内酰胺酶中三个 “热点” 区域的氨基酸替换、插入或缺失有关，包括 Ω 环区域（164 - 179 位氨基酸）、237 - 243 环和 266 - 275 环。其中，Ω 环区域的变异研究较多，而其他两个热点区域突变对与 AVI 和 REL 抑制剂相互作用的影响数据不足。KPC-14 是一种携带 ΔG242-T243 双缺失的变体，可提高部分临床分离株对 CZA 的最低抑菌浓度（MIC），本研究旨在探究该双缺失的生化影响。
结果与讨论
- KPC-14 介导的耐药性及动力学特征评估：通过测定对 β- 内酰胺类抗生素及与 β- 内酰胺酶抑制剂组合的 MIC，评估 KPC-14 与 KPC-2 的耐药差异表型。结果显示，KPC-14 产生的重组克隆对氨苄西林、氨苄西林 - 舒巴坦、头孢噻吩和头孢曲松 - 克拉维酸的 MIC 较 KPC-2 降低；对头孢他啶及其与阿维巴坦组合的 MIC 升高；亚胺培南、美罗培南和亚胺培南 - 瑞来巴坦组合的 MIC 处于敏感范围。
测定两种酶的动力学参数发现，KPC-14 中 ΔG242-T243 缺失影响多数测试的青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类的水解效率（kcat/KM），除头孢他啶和头孢吡肟外。其中，氨苄西林、亚胺培南和美罗培南的kcat/KM值变化显著降低。对于青霉素，氨苄西林水解下降更明显；头孢菌素中，KPC-14 水解头孢噻吩效率减半，对头孢曲松水解效率与 KPC-2 相似，而对头孢他啶和头孢吡肟水解效率分别提高 30 倍和 3 倍；KPC-14 对碳青霉烯类水解有负面影响，可能导致碳青霉烯酶活性丧失。这些结果表明，KPC-14 的酶学特征与 KPC-2 不同，且水解效率与 MIC 值相关。
- KPC-14 中的双缺失降低阿维巴坦和瑞来巴坦的亲和力和酰化速率：为了解 KPC-14 重组克隆中头孢他啶 - 阿维巴坦 MIC 升高而对亚胺培南 - 瑞来巴坦敏感性不变的原因，测定两种 DBO 抑制剂对 KPC-14 和 KPC-2 的抑制参数。结果显示，KPC-14 对两种抑制剂的亲和力均低于 KPC-2，对 REL 的亲和力下降更明显。同时，该缺失还影响两种抑制剂的酰化速率，KPC-14 被 REL 和 AVI 酰化的速率比 KPC-2 慢得多。
这些生化特征解释了表型耐药现象，即 CZA 对 KPC-14 产生的克隆体外生长抑制效果不佳，而亚胺培南 - 瑞来巴坦组合因 KPC-14 对亚胺培南水解减少，使得降低的瑞来巴坦抑制作用被体内增强的亚胺培南疗效所抵消，从而对 KPC-14 产生的克隆有抑制效果。此外，KPC-14 对 AVI 和 REL 的抑制效率低于 KPC-2，也反映在头孢曲松与两种 DBO 抑制剂组合的 MIC 值上。
- 与 KPC-2 不同，KPC-14 无法水解克拉维酸：KPC-2 不能被经典 β- 内酰胺抑制剂有效抑制，为探究 KPC-14 是否有相同行为，测定其对克拉维酸的动力学抑制参数。结果显示，克拉维酸对 KPC-14 的亲和力比 KPC-2 高 10 倍，且 KPC-14 无法水解克拉维酸，而 KPC-2 可水解。这表明 KPC-14 能被克拉维酸有效抑制，其动力学特征更符合超广谱 β- 内酰胺酶（ESBL），而非 KPC-2 这种丝氨酸碳青霉烯酶，且与头孢曲松 - 克拉维酸组合的 MIC 值结果一致。
- KPC-14 脱辅基酶及与头孢他啶和 DBO 抑制剂复合物的计算机模拟：为关联 KPC-14 和 KPC-2 的表型和动力学差异，对 KPC-14 进行计算机模拟。结果显示，KPC-14 的 ΔG242-T243 突变导致 β3-β4 环缩短，虽未显著改变活性位点相关残基位置，但使 Y241 向上位移进入蛋白质核心，改变了区域疏水性。
RMSF 分析表明，KPC-14 的 Ω 环、237 - 243 环和 266 - 275 环灵活性更高，这些区域的结构稳定性受影响。例如，KPC-2 中 N136 与 E166 形成的氢键在 KPC-14 中被破坏，Ω 环中 L169 和 N170 的构象灵活性增加，I173 和 Y241 的疏水相互作用减弱。此外，KPC-14 的活性位点体积比 KPC-2 大，利于容纳更大底物，影响底物特异性和抑制剂敏感性。
模拟 KPC-14 与头孢他啶结合发现，其 Ω 环有序，N170 可能因头孢他啶的氨基噻唑位置而位移，且氨基噻唑环更靠近 237 - 244 环，避免与 Ω 环冲突，这解释了 KPC-14 对头孢他啶水解速率增加的原因。对 KPC-14 与 AVI 和 REL 复合物的模拟未发现与相关活性位点残基相互作用的显著差异，但推测 237 - 243 环缩短导致的活性位点疏水性改变可能干扰 AVI 和 REL 的最佳酰化。
结论
研究新兴 KPC 变体的生化特征对理解临床分离株产生的耐药机制和优化抗菌治疗至关重要。ΔG242-T243 突变使 KPC-14 对头孢他啶水解效率提高，但降低了对青霉素和部分头孢菌素的活性，还导致碳青霉烯酶活性丧失。同时，阿维巴坦抑制效率低且头孢他啶水解增加，使得 CZA 对 KPC-14 的疗效受损。
本研究首次报道瑞来巴坦对 KPC-14 的抑制动力学数据，亚胺培南水解低效和瑞来巴坦抑制低效共同解释了亚胺培南 - 瑞来巴坦组合对 KPC-14 产生的克隆的有效抑制作用。然而，亚胺培南或美罗培南单独或与经典 β- 内酰胺抑制剂联合治疗产 KPC 变体肺炎克雷伯菌感染的有效性仍不明确。此外，开发能检测 KPC 基因突变独特表型的快速分子检测方法对优化治疗策略意义重大。研究还推测，237 - 243 环的缺失可能通过与 Ω 环突变不同的机制导致 CZA 耐药。
材料与方法
- 细菌菌株和质粒：KPC-2 基因从临床肺炎克雷伯菌菌株中获取，大肠杆菌 TOP10 F′ 和 BL21 (DE3) 分别用于转化实验和蛋白过表达实验，大肠杆菌 ATCC 25922 和 ATCC 35218 作为药敏试验对照菌株。使用多种质粒载体进行基因克隆和表达。
- 化学试剂：购买多种化学试剂和抗生素，部分由当地制药公司捐赠。
- 重组 DNA 方法：通过 PCR 扩增 KPC-2 基因并克隆到 pGEM-T Easy 载体，经测序验证后，以其为模板通过定点突变获得 KPC-14 基因。再将 KPC-2 和 KPC-14 编码基因分别克隆到 pMBLe 和 pET24a (+) 载体，转化大肠杆菌 TOP10F′ 细胞，筛选重组克隆并测序验证。
- 抗菌药敏试验：采用肉汤微量稀释法测定不同 β- 内酰胺类抗生素及与 β- 内酰胺酶抑制剂组合的 MIC，实验使用含 50 μM IPTG 的 Mueller Hinton 肉汤，并设置对照菌株。
- 酶的过表达和纯化：将重组质粒 pET24a (+)/bla 转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，优化诱导条件分别表达 KPC-2 和 KPC-14。通过离心、超声破碎细胞，透析、阳离子交换层析等步骤纯化蛋白，SDS-PAGE 分析纯度，UV 吸收法测定蛋白浓度，纯化后的酶储存于 - 80°C 用于后续动力学实验。
- 动力学：使用 T80 UV/Vis 分光光度计在室温下测定稳态动力学参数，根据底物情况采用不同方法计算KM、Vmax、kcat等参数。采用直接竞争法测定抑制剂的抑制常数KIapp，通过拟合进度曲线计算酰化速率（k2/K）。同时测定 KPC-14 和 KPC-2 对克拉维酸的抑制参数，监测克拉维酸水解情况。
- 脱辅基和酰基酶复合物的计算机模拟：以 KPC-2 的 X 射线结构为模板，使用 Swiss-Model 对 KPC-14 进行计算机模拟，用 Yasara 对酰基酶复合物进行能量最小化，用 PyMOL 可视化模型。对 KPC-2 和 KPC-14 进行分子动力学模拟，计算 RMSF、二面角、氢键等参数，使用 MDpocket 测量结合口袋体积。
