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本文研究了两个邻近葡萄园葡萄微生物群落差异及酿酒过程中的变化。发现葡萄品种、葡萄园位点影响微生物群落，酿酒厂环境有一定作用。成果为理解微生物多样性影响葡萄酒生产提供依据，支持微生物风土概念。
引言
葡萄酒是微生物作用的产物，在传统 “天然” 葡萄酒发酵中，葡萄园和酿酒厂的微生物负责葡萄汁发酵。微生物代谢对葡萄酒品质至关重要，葡萄相关微生物群呈现生物地理模式，这一现象引出 “微生物风土（microbial terroir）” 假说，即葡萄相关微生物群的区域差异可能导致葡萄酒品质的区域和位点特异性变化。
众多研究表明，葡萄和葡萄酒微生物群存在时空变化。同一葡萄品种在不同地理位置的葡萄园，其微生物群落不同，且发酵前的葡萄微生物组与发酵后代谢物的差异产生有预测性关联。然而，关于哪些生物和非生物因素塑造葡萄相关的位点特异性微生物群落，以及这些群落在酿酒过程中的稳定性，仍有许多问题待解。
酿酒厂环境也是微生物传播的媒介，但此前不清楚这些微生物的来源，以及葡萄微生物群在果实加工过程中的波动程度。明确微生物群落在生产酿酒过程中的变化，对理解微生物风土至关重要。本研究旨在探究葡萄微生物群在加工过程中的波动，以及酿酒厂微生物的潜在贡献，包括果蝇携带的微生物。
材料与方法
- 葡萄园位点：从加州戴维斯的两个教学葡萄园 RMI（38.53155, ?121.7542）和 Tyree（38.52675, ?121.78946）采集果实微生物群落样本。两葡萄园相距 3.15km，均种植霞多丽（Chardonnay），采用常规种植方式。RMI 葡萄园紧邻加州大学戴维斯分校教学酒厂和 80 号州际公路，Tyree 葡萄园位于小溪和机场之间，周围是农田。此外，Tyree 葡萄园还种植了其他品种，本研究对这些品种进行采样，以考察葡萄园内部的变化及加工过程中的组成变化。
- 样本采集：从葡萄藤上无菌采集浆果，在每个葡萄园的不同行选取多株葡萄采样。在果实加工过程中，从去梗机采集压碎果实（must）样本，从压榨机按一定时间间隔采集汁液样本。同时，对酿酒设备表面进行无菌擦拭采样，从发酵大厅捕获果蝇（Drosophila spp.）并采样。
- 样本处理：葡萄样本带回实验室后立即无菌压碎，汁液冷冻保存。果实采摘后在酒厂单独加工，样本按既定方法处理，包括离心、洗涤、裂解等步骤。
- 微生物组标记基因扩增子测序和数据分析：对 16S rRNA 基因的 V4 区域和内部转录间隔区 1（ITS1）进行扩增和测序。利用 QIIME 2 微生物组生物信息学框架对数据进行分析，包括去复用、降噪、分类学注释、多样性分析等。通过主坐标分析（PCoA）降低维度并可视化，使用随机森林监督分类模型预测样本类型、葡萄园和品种。
- 网络分析：合并 V4 和 ITS 数据集的扩增子序列变体（ASV）计数数据，构建共现网络和二分网络，以研究微生物之间的关系和样本与 ASV 之间的关系。
结果
- 葡萄微生物群表现出葡萄园位点和品种差异：比较两个葡萄园葡萄样本及压榨后的 must 样本的细菌和真菌群落，发现葡萄品种对微生物群落多样性和组成影响显著，其解释的方差量最大。不同品种葡萄的细菌和真菌 β 多样性（通过 PERMANOVA 检验，P值 = 0.001）和 α 多样性（通过 ANOVA 检验，P值 < 0.001）存在显著差异，且这种差异在葡萄加工和压榨后仍保留在 must 样本中。基于 k-mer 组成的 β 多样性 R2值最高，表明葡萄品种差异由遗传多样的细菌和真菌物种驱动。随机森林分类模型能高精度预测葡萄品种。
研究还发现，同一品种（霞多丽）在两个葡萄园的 β 多样性存在显著差异，Tyree 葡萄园的细菌和真菌 ASV 丰富度及 Shannon 多样性更高。随机森林分类器能有效区分两个葡萄园，且在葡萄样本中检测到不同的发酵酵母物种，如Hanseniaspora在 Tyree 葡萄园频繁出现，在 RMI 葡萄园几乎缺失。
- Must 微生物群揭示酿酒厂微生物群的印记，但保留位点特异性特征：PERMANOVA 检验表明，考虑葡萄园位点和葡萄品种后，葡萄和 must 的微生物群存在显著差异。与葡萄相比，must 中细菌 α 多样性略有增加，真菌均匀度降低但丰富度不变。Must 微生物群在组成上介于葡萄和酿酒设备样本之间，网络分析显示 must 与葡萄、设备或果蝇共享不同的微生物物种，随机森林分类器能高精度区分不同样本类型。
- 酿酒厂中的果蝇：发酵酵母的储存库？：果蝇相关微生物群落的 α 和 β 多样性与其他样本类型差异显著，其发酵酵母和Wolbachia相对丰度高，且Saccharomyces spp. 几乎仅在果蝇中发现，不同亚群的Hanseniaspora在葡萄园和酿酒厂环境中分布不同。
- 加工对葡萄 must 微生物群的影响：在加工过程中，葡萄 must 的真菌群落发生变化，丝状真菌相对丰度下降，发酵酵母相对丰度上升，而细菌群落无明显趋势。这表明发酵酵母可能在此时开始生长，或丝状真菌在压榨过程中被选择性去除。
讨论
解析葡萄酒生产系统中微生物生物地理学的驱动因素具有挑战性。本研究对比两个条件相似的葡萄园，跟踪其微生物群落在发酵前酿酒过程中的变化。结果表明，酿酒厂环境虽会向葡萄 must 中释放微生物，但葡萄园的微生物群落特征在定量上保持完整，两个邻近葡萄园的微生物群落差异在加工后仍存在。
本研究首次展示了葡萄压榨过程中葡萄酒相关酵母丰度的变化，但由于样本量限制，该发现未得到统计检验。此外，此前研究虽表明葡萄品种影响微生物群落，但在葡萄园内部尺度的研究较少，本研究虽发现品种聚类可能受基因型影响，但仍需进一步研究解析。
果蝇在葡萄园和酿酒厂生态系统中可能是酵母传播的重要载体，还可能携带细菌污染物和其他真菌。本研究也存在一些局限性，如 16S rRNA 基因引物影响测序效率，葡萄园存在部分差异因素，果蝇鉴定基于形态学等。未来研究可针对这些问题改进。
结论
本研究对两个邻近葡萄园的葡萄采样，发现即使环境相似，霞多丽葡萄仍具有不同的真菌和细菌群落，且这些差异在单一酿酒厂加工过程中持续存在。微生物群落结构在果实加工过程中发生变化，酿酒厂设备和果蝇是微生物的重要储存库，尤其是发酵酵母。葡萄园特异性微生物群落对葡萄酒品质特征有重要贡献，为理解微生物多样性影响葡萄酒生产提供了依据，支持了微生物风土概念。
