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本文开发了一种基于 122 蛋白的双抗原夹心酶联免疫吸附测定法（DAgS-ELISA）用于检测羊痘病毒（CaPV）抗体。该方法灵敏度达 94.7%、特异性达 96.3%，与商业试剂盒一致性高，且早期检测优势明显，为疫病监测、防控及疫苗评估提供有力工具。
引言
羊痘病毒属（Capripoxvirus，CaPV）包含疙瘩皮肤病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）、山羊痘病毒（goatpox virus，GTPV）和绵羊痘病毒（sheeppox virus，SPPV） ，可致使家畜患上相应疾病。这些病毒传染性强，会在动物皮肤和器官表面形成结节、水肿，严重降低牛羊皮革质量，影响生产性能和经济价值，威胁牛羊养殖产业。
CaPV 的基因组为线性双链 DNA，成员间核苷酸相似度达 96%-97%，且宿主特异性不严格，难以依据宿主和临床症状区分这三种病毒。现有的诊断方法如病毒中和试验（VNT）、间接免疫荧光试验（IFA）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等存在不足，VNT 需操作活病毒且耗时，IFA 耗时且特异性差，二者还有生物安全问题。目前针对 CaPV 抗体的 ELISA 较少，因此开发高特异性、灵敏、便捷、准确的诊断方法很有必要。
ORF122 基因位于 GTPV 的中央编码区，高度保守且遗传稳定。其编码的 122 蛋白作为 CaPV 囊膜成分，抗原性和免疫原性显著。此前研究表明，用重组 SPPV - 122 蛋白免疫兔子可产生具有病毒中和活性的抗体，且该蛋白适合在原核系统表达，在 CaPV 感染诊断和疫苗研究中极具价值。本研究以此蛋白为固相抗原和酶标抗原，建立了高灵敏度和特异性的 DAgS-ELISA，用于监测 CaPV 抗体和评估免疫反应。
材料和方法
实验材料包括多种病毒的阳性、阴性血清，如 LSDV、GTPV、SPPV、口蹄疫病毒 O 型（FMDV-O）、羊口疮病毒（ORFV）、布鲁氏菌（Brucella）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等，还有大肠杆菌（Escherichia coli）BL21 (DE3) 受体细胞、多种试剂盒和仪器等。
选择 17 株 CaPV（4 株 GTPV、9 株 LSDV 和 4 株 SPPV）进行 122 基因序列同源性分析，预测 122 蛋白跨膜螺旋，获取胞外区域用于表达。
根据 122 蛋白结构预测，选取其非跨膜区域（氨基酸 68 - 196 位），克隆到 pET-SUMO 载体，转化至E. coli BL21 (DE3) 细胞，诱导表达，经超声破碎、离心后，用 SDS-PAGE 分析蛋白表达形式。
确定蛋白表达最佳条件后，大量生产目标蛋白，经镍柱层析纯化，用 SDS-PAGE 验证，Western blotting 鉴定其与 CaPV 阳性、阴性血清的反应性。之后用 SUMO 蛋白酶酶切，再经 Ni2+亲和层析去除标签，获取 122 蛋白。
按照 HRP 标记试剂盒说明，对 r122 蛋白进行标记，标记后透析、离心，收集上清分装保存于 - 80°C。
通过棋盘滴定法确定 r122 蛋白包被浓度和 HRP - 122 稀释度。将 122 蛋白以不同浓度包被 ELISA 板，封闭后加入 CaPV 阳性、阴性血清，再加入不同稀释度的 HRP - 122，最后加入显色底物和终止液，以最大 P/N 值确定最佳反应条件，进而确定最佳血清稀释度。
在优化的 ELISA 条件下，检测 109 份阴性血清和 57 份阳性血清，计算 S/P 值
，绘制受试者工作特征曲线（ROC），计算约登指数（Youden index = 灵敏度 + 特异性 - 1），以最大约登指数对应的 S/P 值为临界值。
用 DAgS-ELISA 检测血清中针对 LSDV、GTPV、SPPV、Brucella、ORFV、FMDV 和 BVDV 的抗体，评估特异性；将 LSDV、GTPV 和 SPPV 阳性血清梯度稀释后检测，评估灵敏度；选取已知背景血清，通过计算批内和批间变异系数评估重复性。
选取 5 头 CaPV 抗体阴性的牛，接种 LSDV 灭活疫苗，设 1 头对照。分别在接种后 0、7、14、21、28、35 天采集血清，检测抗体水平，绘制抗体消长曲线，并与商业试剂盒检测结果对比。
用 ID Screen Capripox Double Antigen Multi-species 试剂盒和 DAgS-ELISA 同时检测 150 份临床血清样本，分析两种方法的一致性。
结果
17 株 CaPV 的 122 基因序列同源性不低于 93.4%，证实其高度保守。根据结构预测，选择非跨膜区域表达。
SDS-PAGE 分析显示 r122 蛋白分子量约 26kDa，Western blotting 表明纯化的 r122 蛋白与 CaPV 阳性血清反应性强。
确定最佳反应条件为包被抗原浓度 2μg/mL、酶标二抗稀释比 1:60,000，最佳血清稀释比 1:2，血清和酶标抗原最佳孵育时间 30min。
ROC 分析显示，建立的检测方法曲线下面积（AUC）为 0.997，临界值为 0.304 时，约登指数最高，诊断灵敏度达 94.7%，特异性达 96.3%。
特异性检测表明，该方法与Brucella、ORFV、FMDV 和 BVDV 阳性血清无交叉反应；灵敏度检测显示，对 LSDV 和 GTPV 的检测灵敏度可达 1:32，对 SPPV 为 1:16；重复性检测中，批内和批间变异系数均小于 10%，表明重复性良好。
抗体动力学监测显示，DAgS-ELISA 在免疫后 14 - 21 天就能检测到部分动物抗体反应，28 天所有免疫动物均呈阳性反应并持续到 35 天；而商业试剂盒在 21 天前无法检测到抗体反应，在部分样本检测中表现较差。
两种方法检测 150 份临床血清样本，Kappa 值为 0.759，一致性较高。
讨论
LSD、GTP 和 SPP 对牛羊及其产品的贸易和产业发展影响深远。CaPV 各毒株遗传相似，存在交叉感染风险，建立早期、快速、准确的抗体检测方法对疫病防控至关重要。目前国内 CaPV 流行毒株情况不明，给疫病管理带来挑战。
DAgS-ELISA 基于待测抗体与固相抗原、酶标抗原形成的结合物进行检测，能减少非特异性抗体干扰，降低假阳性，提高检测的特异性和灵敏度，还具有高效、便捷、降低交叉污染风险等优势。
ELISA 中特异性抗原的选择很关键。122 蛋白作为 EEV 囊膜成分，遗传保守、结构简单易表达，去除跨膜结构域不影响抗原位点和生物活性，免疫原性良好，与其他牛羊常见病原体无交叉反应，特异性强。
目前 IDVet 的商业试剂盒是唯一能检测三种 CaPV 的试剂盒。本研究建立的 DAgS-ELISA 与之一致性高，但在少数血清样本检测上存在差异。抗体动力学分析显示，DAgS-ELISA 早期检测能力更强，能在免疫早期检测到 IgM，之后总抗体水平逐渐上升。而商业试剂盒在 21 天前无法检测到抗体，部分样本检测结果不佳。这可能是商业试剂盒对个体免疫反应差异不敏感导致的。DAgS-ELISA 能高灵敏度和特异性地检测包括 IgM 和 IgG 在内的多种抗体，适合评估临床免疫效果，但目前只能检测总抗体，区分近期和远期感染还需进一步研究。
在 CaPV 感染流行地区，本研究方法 96.3% 的高特异性意义重大。现有诊断方法存在局限性，新方法特异性高，适合流行病学研究和疫苗诱导抗体反应评估，且与其他常见病原体无交叉反应，灵敏度达 1:32，重复性好，与商业试剂盒一致性高，适用于临床血清样本高通量检测，为牛羊养殖场免疫方案制定提供了理论和数据支持，是防控 CaPV 感染传播、监测抗体和开展流行病学调查的有效工具。
