三重实时逆转录重组酶辅助扩增技术同步检测SARS-CoV-2、甲型流感病毒与呼吸道合胞病毒

这篇研究开发了一种基于三重实时逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）的多重检测方法，可在42°C恒温条件下30分钟内同步检测SARS-CoV-2、甲型流感病毒（IAV）和呼吸道合胞病毒（RSV）。其检测限（LOD）分别为138、198和162拷贝/反应，与三重RT-qPCR（100拷贝/反应）量级相当，且无交叉反应。临床验证显示100%灵敏度与特异性，为呼吸道病原体快速筛查提供了高效、便携的解决方案。

　　

ABSTRACT
流感病毒（IAV）、SARS-CoV-2和呼吸道合胞病毒（RSV）是引发人类呼吸道症状的重要病原体，其临床特征高度相似且存在共感染现象。传统RT-qPCR检测耗时长且依赖中心实验室，而本研究建立的triplex RT-RAA技术可在30分钟内完成同步检测，灵敏度达10²拷贝量级，临床样本验证显示与RT-qPCR完全一致（Kappa=1）。

INTRODUCTION
SARS-CoV-2引发的COVID-19大流行已造成全球超7.71亿病例，而IAV和RSV同样导致高发病率。三者共感染率可达8.4%，但临床表现重叠（发热、咳嗽等），亟需快速鉴别诊断技术。传统RT-qPCR受限于设备与时间成本，重组酶辅助扩增（RAA）因其37–42°C恒温、30分钟快速反应的特点成为理想替代方案。

MATERIALS AND METHODS
研究采用58份临床样本（咽拭子、肺泡灌洗液等），通过DNASTAR软件比对IAV-M基因、SARS-CoV-2-N基因和RSV-N基因保守区域设计引物/探针。探针采用FAM/TAMRA/ROX荧光标记与BHQ淬灭系统，THF间隔基阻断延伸。优化后的三重RT-RAA体系含三组引物探针（表1），在QuantStudio系统实时监测荧光信号。

RESULTS

1. 保守靶标定位：IAV-M、SARS-CoV-2-N和RSV-N基因的引物探针位点在所有测试毒株中完全保守（图1）。
2. 引物筛选：两轮筛选获得最佳组合，如SARS-CoV-2的F805-834/R940-969（图2）。
3. 特异性：仅对目标病毒响应，与副流感病毒（HPIV1/3）、腺病毒（HAdV）等14种病原体无交叉（图3）。
4. 灵敏度：检测限为138–198拷贝/反应（图4G-I），与RT-qPCR相当（图4A-F）。
5. 临床验证：58份样本检测结果与RT-qPCR完全一致（表2），灵敏度/特异性均达100%。

DISCUSSION
相比RT-qPCR（需1小时）和LAMP（60–65°C高温），RT-RAA在42°C恒温下实现超快检测，且成本低于依赖噬菌体重组酶的RPA。研究首次实现三病毒同步检测，但未提取RNA的样本灵敏度显著降低（Ct>33时需核酸纯化）。未来可结合CRISPR或微流控技术进一步提升性能，适用于基层医疗和大规模筛查。

ACKNOWLEDGMENTS
研究受广东省科技计划（2022B1111010004）、广州市基础研究计划（2023A03J0811）等资助，由广州医科大学附属市八医院团队完成。