肌肉外周生物钟通过调节 Ror/Rev-erb 平衡驱动夜间蛋白质降解，预防肌肉减少症

这篇研究发现肌肉外周生物钟可促进夜间自噬和泛素 - 蛋白酶体系统（UPS）活性，限制幼虫肌肉生长。Ror 和 Rev-erb 的平衡变化驱动夜间分解代谢，肌肉时钟缺失会导致肌肉功能衰退和类似肌肉减少症（sarcopenia）的症状，为相关疾病治疗提供新思路。

　　

研究背景

昼夜节律紊乱与多种健康问题相关，如轮班工作、睡眠剥夺或痴呆症等导致的昼夜节律破坏，会增加肌肉减少症（sarcopenia）的风险，即与年龄相关的肌肉质量和力量丧失。然而，昼夜节律紊乱的细胞内在和外在影响，以及肌肉减少症的机制基础尚不清楚。骨骼肌拥有自主的昼夜节律时钟，对其生理、代谢和生长很重要，但肌肉内在的昼夜节律机制仍不明确。

实验方法

研究人员构建了转基因斑马鱼品系 Tg (actc1b:EGFP - 2A - ΔCLK - 5xMyc)^kg333（简称 mΔCLK），该品系在肌肉肌动蛋白启动子下表达 EGFP 和 Myc 标记的显性负性 Clock 蛋白（ΔCLK），用于研究肌肉外周时钟的细胞自主作用。通过检测 mRNA 和蛋白质水平、分析蛋白质降解和合成、观察肌肉生长和功能变化等实验，探究肌肉外周时钟对肌肉生长、蛋白质代谢的调控机制。实验中的斑马鱼胚胎在 3 日龄（dpf）前在 12 小时光照 / 12 小时黑暗的周期中进行同步化，之后在不同条件下进行处理和分析。实验遵循英国 1986 年《动物（科学程序）法案》的许可进行。

实验结果

1. 抑制肌肉时钟对肌肉时钟控制基因和昼夜肌肉生长的影响：mΔCLK 转基因斑马鱼中，ΔCLK 在肌肉中特异性表达，有效抑制了肌肉时钟输出，消除了肌肉时钟控制基因（CCGs）mRNA 的节律性。mΔCLK 肌肉在夜间生长速度比对照组快约两倍，消除了昼夜生长差异，且这种夜间生长增强与身体活动无关。
2. mΔCLK 对幼鱼和衰老过程中肌肉质量稳态的影响：在 3dpf 时，mΔCLK 肌肉比对照组小约 5%；4dpf 时，mΔCLK 肌肉比对照组大 10%。5dpf 后，mΔCLK 肌肉与对照组的差异在喂食幼鱼 / 幼体中消失。成年后，mΔCLK 鱼在 12 个月龄（mpf）前生长正常，但 24mpf 时生长停滞，体重、体长和标准体重降低，身体质量指数（BMI）下降，且活动能力减弱，表明肌肉内在时钟对维持衰老过程中的肌肉质量和功能至关重要。
3. MuRF 介导的泛素化在夜间的作用：肌肉特异性 E3 连接酶 MuRF 的 mRNA 和蛋白质在夜间表达量最高，其活性与夜间蛋白质泛素化水平相关。抑制 MuRF 可减少夜间泛素化蛋白质的丰度，增加肌肉大小，促进夜间肌肉生长，表明 MuRF 在夜间通过诱导蛋白质降解限制肌肉生长。
4. UPS 对肌肉新生蛋白质周转的贡献：通过分析体内新生肌肉蛋白质的周转，发现 UPS 参与了新生肌肉蛋白质的降解，新生蛋白质在夜间的降解率约为 50%，UPS 抑制剂 MG132 可减弱这种降解。
5. 肌肉 ΔCLK 表达对蛋白酶体降解的影响：肌肉时钟抑制消除了 MuRF 转录物的振荡，降低了夜间蛋白质泛素化水平，但蛋白酶体活性基本不变，表明肌肉时钟通过泛素化而非蛋白酶体活性调节蛋白酶体降解。此外，抑制肌肉时钟和抑制 MuRF 对促进夜间肌肉生长的作用不具有加性，说明它们作用于同一途径。
6. 自噬降解对夜间肌肉生长的限制作用：自噬相关基因如 ulk1_a和 ulk1_b的转录本以及 Ulk1 蛋白在夜间振荡并积累，Ulk1^Ser757 - P/Ulk1 比值在夜间最低，表明自噬在夜间被激活。抑制自噬可促进夜间肌肉生长，但会降低肌肉功能，且抑制 UPS 和自噬对肌肉生长的影响不具有加性，说明肌肉蛋白质在夜间通过 UPS 和自噬两条途径降解。
7. 肌肉时钟抑制对自噬的影响：肌肉时钟抑制后，Ulk1 的 mRNA 振荡受到干扰，但 Ulk1 蛋白仍呈周期性变化。mΔCLK 鱼在夜间 Ulk1^Ser757的磷酸化增加，抑制了自噬。通过检测 EGFP - LC3 融合蛋白和 mCherry - p62 的积累，发现 mΔCLK 肌肉中自噬体形成减少，自噬通量降低。
8. Rorc/Nr1d1 时钟激活剂 / 抑制剂比例对夜间肌肉生长的控制作用：使用小分子化合物 SR9011（Nr1d1/2 激动剂）和 SR8278（Nr1d1/2 拮抗剂）处理斑马鱼，发现 SR9011 可促进夜间肌肉生长，而 SR8278 无此作用。过表达 Nr1d1 可使肌纤维增大，过表达 Rorca/b 则使肌纤维变小，表明 Rorc/Nr1d1 平衡调节肌肉纤维生长速率。
9. Rorc/Nr1d1 比例对肌肉中 TORC1 信号通路和自噬的影响：Nr1d1 激活通过激活 TORC1 信号通路抑制自噬，导致 Ulk1^Ser757磷酸化增加和自噬通量降低。Rorc/Nr1d1 比例的变化可调节 TORC1 活性，进而影响自噬。例如，增加 Rora/c 与 Nr1d1/2 的比例可通过提高 Tsc 水平抑制肌肉 TORC1 活性，促进自噬。
10. 肌肉昼夜节律时钟通过 Nr1d1 - TORC1 轴限制夜间生长：mΔCLK 肌肉在夜间 TORC1 活性升高，抑制自噬。使用雷帕霉素（rapamycin）抑制 TORC1，可减少 mΔCLK 鱼夜间的额外生长。改变 Nr1d1/2 活性可影响 mΔCLK 鱼夜间的异常高生长速率，表明昼夜节律变化中的自噬和肌肉生长由肌肉外周时钟的 Rora/c 和 Nr1d1/2 平衡维持。

研究结论

1. 肌肉外周时钟促进夜间蛋白质周转限制早期生长：肌肉外周时钟在夜间激活 UPS 和自噬，限制早期肌肉生长。UPS 和自噬分别负责斑马鱼幼虫夜间约一半的新生肽降解，且两者对生长的影响无加性。肌肉时钟通过 MuRFs 驱动蛋白酶体降解，通过调节 TORC1 介导的 Ulk1 磷酸化调控自噬，而白天肌肉生长可能由非肌肉组织时钟调节。
2. 高肌肉 Ror/Rev - erb 比例上调夜间 UPS 和自噬：肌肉时钟稳定环中的动力学延迟控制夜间分解代谢的时间。Rorc 和 Nr1d1/2 分别在夜间和白天占主导地位，它们的靶标相应地被激活或抑制。肌肉时钟通过调节 TORC1 活性来调控自噬，可能通过 Tsc1/2 等 TORC1 抑制剂实现，且 UPS 和自噬的昼夜节律调节可能在 TORC1 信号通路水平汇聚。
3. 肌肉时钟对预防肌肉大小和功能衰退的作用：肌肉时钟在早期发育中可能依赖非肌肉时钟支持，成熟后则自主限制生长。在独立进食后，mΔCLK 幼虫的生长优势消失，但随着年龄增长，mΔCLK 鱼出现肌肉功能衰退和类似肌肉减少症的症状，可能是由于蛋白质降解减少导致缺陷蛋白积累。研究肌肉外周时钟对肌肉蛋白质降解的调控，有助于缓解与昼夜节律紊乱相关的肌肉力量和质量损失，为治疗相关肌肉疾病的时间精准医学发展提供依据。

研究局限性

mΔCLK 鱼中核心时钟基因 mRNA 节律变化不如 null 小鼠明显，可能原因包括检测组织含非肌肉组织、mΔCLK 转基因不完全抑制 Bmal1:Clock 功能、来自脑和非脑时钟的同步信号维持转录节律以及未干扰肌肉内在非转录节律等。Ror/Nr1d1 平衡模型需进一步验证蛋白质水平和活性与 mRNA 的对应关系，且其他肌肉时钟输出可能也有贡献。此外，肌肉收缩功能障碍的原因尚不清楚，需要更多直接证据证明 mΔCLK 鱼肌肉中肌节蛋白或代谢的分子缺陷。