人细胞色素P450酶催化木犀草素氧化代谢生成更强效Nrf2激动剂的机制及肝保护作用研究

本研究针对木犀草素(PEC)的氧化代谢途径及其对生物活性的影响展开深入探索。研究人员通过LC-TOF-MS/MS等技术鉴定出PEC在人体肝微粒体(HLM)中的主要代谢产物hispidulin(HIS)，发现CYP1A2和CYP2D6是催化PEC 4'-O-去甲基化的关键酶。研究发现HIS作为更强效的核因子E2相关因子2(Nrf2)激动剂，能显著增强对乙酰氨基酚(APAP)诱导肝细胞损伤的保护作用，为阐明PEC的体内代谢命运及其药理活性变化提供了重要依据。

　　

在传统中医药宝库中，菊科植物大蓟（Cirsii Japonici Herba）作为治疗炎症、癌症和心血管疾病的常用药材已有数百年历史。近年来研究发现，大蓟及其碳化产物中的主要活性成分木犀草素(Pectolinarigenin, PEC)具有显著的肝保护、抗氧化和抗炎活性。然而，这种黄酮类化合物在人体内的代谢命运及其对药理活性的影响始终是未解之谜。随着药物代谢研究的重要性日益凸显，解析PEC的代谢途径对于理解其体内药效物质基础具有重要意义。

为系统阐明PEC的氧化代谢特征及其生物学意义，国内某研究机构的研究团队开展了一项创新性研究。研究人员首先采用液相色谱-飞行时间质谱联用技术(LC-TOF-MS/MS)鉴定出PEC在人体肝微粒体(HLM)中的主要氧化代谢产物，随后通过反应表型分析和酶动力学研究确定了参与代谢的关键细胞色素P450(CYP)酶。在机制研究方面，团队利用荧光素酶报告基因检测和蛋白质印迹等技术评估了PEC及其代谢产物的核因子E2相关因子2(Nrf2)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)激动活性。为验证代谢产物的生物学功能，研究人员还建立了对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝细胞损伤模型，系统考察了代谢产物的肝保护作用。该研究成果发表在《Chinese Herbal Medicines》杂志上。

研究采用的主要技术方法包括：LC-TOF-MS/MS代谢产物鉴定、CYP反应表型分析、酶动力学参数测定、荧光素酶报告基因检测、蛋白质印迹分析、细胞活力检测(CCK-8法)、活性氧(ROS)水平测定、线粒体膜电位(MMP)检测、乳酸脱氢酶(LDH)释放测定和谷胱甘肽(GSH)含量检测等。实验使用的人肝微粒体(HLM)来自50名供体，细胞实验采用HepaRG人肝细胞系。

在"氧化代谢产物的鉴定"部分，研究发现PEC在HLM中可被NADPH依赖性代谢为两种O-去甲基化产物，其中hispidulin(HIS)被确认为主要代谢物。通过LC-TOF-MS/MS分析，确定这些代谢物的分子量比PEC少14Da，符合去甲基化特征。

"多种人P450酶催化PEC 4'-O-去甲基化"的研究显示，至少有9种人CYP酶能催化该反应，其中CYP1A2和CYP2D6表现出最高的结合亲和力和代谢清除率。酶动力学分析进一步证实，CYP1A2和CYP2D6的固有清除率(CL_int)分别达到1.422和1.179 μL/(min·mg)。

关于"PEC 4'-O-去甲基化对其PPARα/β激动活性的影响"，研究发现虽然HIS仍保留PPARα和PPARβ激动活性，但在所有测试浓度(1-5 μmol/L)下均略低于PEC，表明去甲基化轻微减弱了PPAR激动效应。

在"Nrf2激动活性增强"方面，研究获得了突破性发现：HIS在所有测试浓度下都表现出比PEC更强的Nrf2转录激活能力。Western blotting分析显示，HIS能更有效地促进Nrf2核转位，特别是在低浓度(1 μmol/L)时就可显著增加核Nrf2蛋白水平。

关于"HIS显著改善APAP诱导的肝细胞损伤"的研究显示，HIS在5-10 μmol/L浓度下比PEC表现出更强的肝保护作用。机制研究表明，HIS能更有效地降低细胞内ROS积累、提升线粒体膜电位、减少LDH释放并增加GSH含量，这些效应与其更强的Nrf2激活能力高度一致。

这项研究首次系统阐明了PEC在人体内的主要氧化代谢途径及其生物学意义。研究发现CYP催化的PEC 4'-O-去甲基化不仅是一种代谢解毒途径，更是一种"代谢激活"过程，产生的HIS作为更强效的Nrf2激动剂，能显著增强对APAP诱导肝损伤的保护作用。这一发现为理解PEC的体内药效物质基础提供了新视角，也为开发基于代谢激活策略的新型肝保护剂提供了重要线索。

研究还揭示了传统中药炮制增效的潜在分子机制：大蓟碳化后PEC含量显著增加，而PEC经代谢生成的HIS具有更强的生物活性。这种"前药-活性代谢物"关系可能是中药炮制增效的重要机制之一。未来研究可进一步探索HIS与Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)的结合模式，以及其对Nrf2泛素化和降解的具体调控机制，为开发新型Nrf2靶向药物提供更充分的理论依据。