基于细胞计数的支气管肺泡灌洗液mNGS检测灵敏度提升策略：一项实证研究

为解决宿主DNA污染影响宏基因组下一代测序(mNGS)敏感性的临床难题，西安交通大学第一附属医院团队开发了基于AO/PI染色的细胞计数法，通过建立1×106细胞/mL的宿主清除阈值，显著提升高宿主背景样本中病原体检出率（87% vs 65%），同时有效保护脆弱病原体（如耶氏肺孢子菌）的检测完整性。该研究为精准感染诊断提供了可量化的预处理标准。

　　

下呼吸道感染的高病死率一直是临床重大挑战，宏基因组下一代测序(mNGS)技术虽为病原诊断带来曙光，却面临宿主DNA"喧宾夺主"的困境——人类基因组大小是细菌的千倍级，即使微量宿主细胞也会淹没病原信号。更棘手的是，当前主流的选择性裂解(selective-lysis)宿主清除技术如同"双刃剑"：既能将结核分枝杆菌检测限提升100倍至10 CFU/mL，却可能误伤细胞壁脆弱的耶氏肺孢子菌和鹦鹉热衣原体。这种技术应用的两难境地，催生了西安交通大学第一附属医院团队在《Clinica Chimica Acta》发表的创新研究。

研究团队采用多阶段验证策略：首先通过282例BALF样本建立核酸总量与内参读长的负相关模型（R²=0.87）；继而比较三种染色剂在模拟样本中的表现，发现吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)在血性/浑浊样本中保持R²>0.85的线性；最终对144例临床样本实施分层阈值管理，高宿主组(≥1×10⁶ cells/mL)采用宿主清除后阳性率提升22%。

【3.1 样本特性与宿主含量的相关性分析】
突破传统经验判断的局限性，研究发现样本颜色、粘稠度等表观特征与核酸总量无显著相关性（图1），证实肉眼评估的不可靠性。这为开发定量化预处理标准提供了理论依据。

【3.2 BALF样本细胞计数方法】
在模拟临床复杂基质的环境中，AO/PI展现出压倒性优势：在含血样本中保持R²=0.86的计数精度，远超台盼蓝(R²=0.23)和DAPI(R²=0.51)。临床验证显示其与核酸总量的相关性达R²=0.85（图3B），确立其作为"分子天平"的可靠性。

【3.3 BALF样本宿主清除的细胞计数阈值】
分层研究揭示关键拐点：当宿主细胞≥1×10⁶/mL时，常规mNGS漏检率达50%，而宿主清除组可多检出49种病原（表S2）；但对低宿主样本，该处理会导致革兰阴性菌和DNA病毒假阴性率升高。特别值得注意的是，耶氏肺孢子菌在所有真菌中受宿主清除影响最显著，66.7%案例出现信号衰减。

【3.4 AO/PI在临床BALF样本宿主清除判定中的现场测试】
144例实战检测显示，采用细胞计数引导的分层策略后，整体阳性率保持84%的同时，高宿主组检测灵敏度提升显著。但图5数据也警示：耶氏肺孢子菌在宿主清除组的检出率降低6%，提示对免疫抑制患者需辅以PCR验证。

这项研究开创性地将细胞计数从实验室工具转化为临床决策指标，其价值体现在三个维度：技术层面确立AO/PI为复杂BALF样本的金标准染色法；临床层面制定1×10⁶ cells/mL的宿主清除阈值；管理层面构建"量体裁衣"式的检测路径。正如讨论指出，该策略成功平衡了"提高信噪比"与"保护脆弱病原"的矛盾，为感染精准诊断树立了新范式。但研究也揭示局限性，如对寄生虫等病原的覆盖不足，以及样本来源单一等问题，这些都将成为未来多中心研究的优化方向。