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为探究艰难梭菌（C. difficile）历史菌株的系统发育地位及与分子钟模型的契合度，研究人员对 1980 - 1986 年的菌株进行分析。结果发现部分菌株 SNP 差异不符预期，分子钟估计可能更复杂。该研究为艰难梭菌进化研究提供新视角。
在微生物的进化研究领域，艰难梭菌（Clostridioides difficile）一直是备受关注的焦点。它是一种能够引发严重肠道疾病的细菌，尤其是 PCR 核糖体分型（RT）027 菌株，在欧洲广泛流行，与多次国际疫情爆发紧密相关，还对氟喹诺酮类药物具有耐药性。然而，目前对于艰难梭菌的进化历程，特别是 RT027 菌株的演变，仍存在诸多未知。以往研究虽对其进化有一定探索，但许多关键问题尚未明晰，比如 RT027 菌株在进化过程中关键遗传改变的具体机制，以及这些改变与抗菌药物耐药性之间的复杂关联。为了深入了解这些问题，来自国外研究机构的研究人员开展了一项重要研究。该研究成果发表在《Anaerobe》杂志上，为艰难梭菌的进化研究带来了新的曙光。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先，利用 Illumina 测序技术对历史艰难梭菌菌株进行测序，获得序列数据。接着，通过多基因座可变数目串联重复分析（MLVA）和基于特定方法的分子分型技术对菌株进行基因分型。然后，借助已建立的生物信息学流程，进行系统发育分析，包括序列映射、单核苷酸多态性（SNP）检测、构建最大似然树并调整重组影响，还通过计算预测区间和根 - 尖分析来深入探究菌株的进化关系。样本队列来源于 1980 - 1986 年的 75 株历史艰难梭菌菌株，同时纳入了欧洲监测及其他研究中的相关菌株作为对照。
3. 研究结果
3.1 系统发育分析
研究人员通过对不同 RT 序列进行分组、映射到相关参考基因组并构建最大似然树。结果显示，历史菌株一般会与同批收集的其他菌株形成聚类，一定程度上支持了样本的预期年龄。但在与 “现代” 菌株（2012 - 2013 年 EUCLID 研究菌株）比较时，出现了许多不符合当前分子钟预测的情况。例如，RT027 菌株中的 JV67（1986 年）与 2006 年基因组仅相差 2 个 SNP，低于预期下限（4.4 个 SNP）；JV73（1983 年）与 2008 年菌株相差 8 个 SNP，虽高于预期下限（5.5 个 SNP），却超出 95% 预测区间。而在 RT001 菌株中，1983 年的 JV37 和 JV63 与 2013 年相邻基因组的 SNP 差异分别高达 6696 和 6229 个，远超分子钟预测上限（42.0 个 SNP）；1981 年和 1982 年的部分菌株 SNP 差异则在预期范围内。综合来看，仅有 69% 的历史基因组 SNP 差异在预测区间内，且实际观察到的 SNP 差异小于预期的情况更为频繁。
3.2 RT078 菌株分析
历史 RT078 菌株 JV14（1982 年）和 JV22（1981 年）基因组相同，与 2013 年爱尔兰菌株相差 6 个 SNP，低于预期下限，预测区间超出 95% 概率投影（p = 0.0003）。
3.3 RT027 菌株根 - 尖分析
对 RT027 菌株进行根 - 尖分析发现，根 - 尖距离与菌株年龄之间呈弱线性相关（R2 = 0.08），推断 RT027 最常见最近共同祖先的时间为 1946 年。
4. 研究结论与讨论
通过系统发育分析评估艰难梭菌历史菌株的进化地位时，研究发现大部分分析结果虽在一定程度上符合当前分子钟估计，但仍有部分菌株偏离预期。这表明艰难梭菌孢子休眠可能对其进化速率产生比以往认知更大的影响。由于艰难梭菌在休眠孢子状态下遗传复制停止，进化显著变慢，而确定菌株处于该状态的时长十分困难，这给准确确定进化时间关系带来了极大挑战。此外，研究中还发现一些特殊现象，如部分菌株聚类情况与预期不符，可能与样本污染有关；历史 RT027 菌株中 MXF 耐药性的出现早于药物市场引入，为氟喹诺酮耐药谱系的研究增添了新的复杂性。总体而言，该研究强调了在艰难梭菌进化研究中考虑孢子休眠影响的重要性，为后续研究提供了关键方向，有助于深入理解艰难梭菌的进化机制，为防控艰难梭菌感染及应对抗菌药物耐药性问题提供理论依据 。
