基于毛细管电泳技术直接验证细胞裂解液中miRFP670-LIMK1荧光蛋白活性的创新研究及其在药物开发中的应用

本研究针对LIMK1（LIM激酶1）作为治疗神经退行性疾病和癌症的潜在靶点，开发了一种无需纯化步骤、直接在细胞裂解液中通过毛细管电泳（CE）验证荧光标记蛋白miRFP670-LIMK1活性的方法。研究人员证实了该融合蛋白在C端标记后仍保持催化活性，并利用微尺度热泳（MST）测定了其与抑制剂TH-257的解离常数（Kd = 9 nM）。这一成果为药物开发提供了更接近体内条件的酶活性评估工具，同时展示了CE与MST技术在药物筛选中的互补价值。

　　

论文解读

在神经退行性疾病和癌症治疗领域，LIM激酶1（LIMK1）因其调控肌动蛋白细胞骨架的关键作用成为热门靶点。然而，现有抑制剂均未通过临床试验，部分原因在于缺乏在接近生理条件下评估酶活性的可靠方法。传统放射性检测存在安全隐患，而纯化酶可能丧失天然构象。更棘手的是，荧光标记虽便于检测，但可能干扰酶功能——这正是药物开发中的“标记困境”。

为解决这些问题，来自奥尔良大学和鲁昂大学的研究团队在《Analytica Chimica Acta》发表了一项突破性研究。他们创新性地将毛细管电泳（CE）与微尺度热泳（MST）技术结合，直接在HEK293细胞裂解液中验证了C端标记红色荧光蛋白miRFP670的LIMK1（miRFP670-LIMK1）的活性，并评估了其与抑制剂TH-257的相互作用。这项研究首次证明荧光标记不影响LIMK1功能，为药物筛选提供了更接近体内环境的评估平台。

关键技术方法
研究采用PDADMAC涂层毛细管解决生物分子吸附问题，优化了ATP/ADP的CE分离条件（含Mg²⁺的Tris-HCl缓冲体系）。通过监测ADP生成量评估酶活性，结合MST测定miRFP670-LIMK1与TH-257的K_d值。所有实验均在未纯化的细胞裂解液中进行，最大限度保留天然环境。

研究结果

Optimization of ATP and ADP separation
通过调整缓冲液pH（8.5）和添加Mg²⁺，实现了ATP与ADP的基线分离（迁移时间差>1 min）。PDADMAC涂层显著提高了重现性（RSD<5%），解决了裸毛细管在复杂基质中的吸附问题。

Conclusion
CE直接证实miRFP670-LIMK1在裂解液中具有磷酸化活性，TH-257可剂量依赖性抑制该活性。MST测得K_d为9 nM，表明TH-257是强效LIMK1探针分子。

意义与展望
该研究建立了首个在原生环境中验证标记酶活性的CE-MST联用策略，突破了传统方法需纯化酶的局限。其价值体现在三方面：一是证实miRFP670标签不影响LIMK1功能，为荧光标记酶的应用扫清障碍；二是TH-257的亚纳摩尔级活性为神经疾病药物开发提供先导化合物；三是为其他激酶研究提供了“免纯化”评估范式。未来，这种模拟体内条件的技术组合有望加速靶向LIMK1药物的临床转化。