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本文聚焦 SELEX（指数富集配体系统进化技术）和 DNA 适配体，详细阐述其发展历程、技术原理，涵盖文库设计、靶标选择等关键环节，分析常见问题与解决策略，介绍新兴趋势，为新手开展 SELEX 实验提供全面实用的指导。
适配体结构
DNA 适配体是单链 DNA，由两侧的扩增引物和中间的随机核苷酸区域构成。引物长度通常约 20 个核苷酸，随机区域长度在 22 - 220 个核苷酸之间。算上引物，适配体平均大小在 80 - 100 个核苷酸左右，引物约占适配体的 50%。
SELEX 过程概述
SELEX 是分离与目标分子结合的适配体的筛选过程。在典型的 SELEX 流程中，先将目标分子固定在固相载体上。接着，制备 DNA 适配体文库，通过加热 - 冷却步骤（退火）使其形成稳定的三维结构，随后将文库与固相目标分子孵育，部分适配体会与目标结合 。
文库设计
适配体筛选所用核苷酸文库的设计，对 SELEX 实验的成功影响重大。实验的最终目标是分离出对目标分子具有高亲和力和特异性的适配体。选择起始文库时，需要考虑成本、PCR 副产物的可能性以及实验目的等因素。确定这些因素后，研究人员可进一步考虑文库的具体设计。
靶标
SELEX 技术已成功用于分离能结合各种大小差异极大的靶标的适配体。适配体的靶标包括完整的哺乳动物和细菌细胞、病毒、蛋白质、小分子，甚至是功能基团（如甲基和异丁基等）。不同类型的靶标在 SELEX 应用中各有特点。
适配体结合
适配体结合本质上是一种双分子相互作用，受多种因素影响，其选择性结合靶标的能力是适配体功能的关键特征。在 SELEX 过程中，研究人员常将靶标固定在固相支持物上，但这种方式可能改变靶标的构象。
分离与再扩增
成功筛选出与靶标结合的适配体并分离后，需要将其从靶标上洗脱或回收，为下一轮扩增做准备。通常认为洗脱后的适配体扩增很简单，用普通 PCR 扩增方案即可。多数情况下，可通过简单的热洗脱将适配体与靶标分子分离，这一步还能作为后续 PCR 的首次热变性步骤。但实际上，重新扩增并非如此简单。
单链 DNA（ssDNA）的再生
PCR 扩增产生的是双链 DNA，而 SELEX 要进入下一轮筛选，必须先分离出正确极性的单链。SELEX 过程整体可靠性欠佳，有研究报告其失败率高达 70%，分离单链 DNA 时出现的问题是导致成功率低的原因之一。目前有四种回收单链 DNA 的方法：凝胶电泳、不对称 PCR、碱性变性后分离正确单链以及其他方法 。
最终分析
完成预定轮次的 SELEX 筛选后，最终产物仍是多种适配体的混合物。不过，经过多轮筛选和扩增，序列应已得到富集。研究表明，高效富集的文库中约 93% 的序列存在重复，这意味着许多序列经多轮成功扩增，但富集程度因实验而异。SELEX 的最后一步是对筛选结果进行分析。
适配体 - 靶标亲和力评估
筛选和测序后，需通过结合实验评估适配体对靶标的亲和力。常用的评估适配体解离常数（KD）的方法有表面等离子共振（SPR）和酶联适配体吸附测定（ELASA） 。SPR 利用平面偏振光测量分子的结合与解离，以此评估分子亲和力；ELASA 则使用生物素化适配体和检测酶来测定 KD 。
近期应用
近期研究展示了 SELEX 技术在治疗和诊断领域的多项令人瞩目的进展。例如，Li 等人开发了用于呼吸道传染病超灵敏即时检测的量子点侧向流动平台，凸显了适配体在优化临床诊断检测方案方面的潜力；Tsvetkov 等人探究了人工适配体 BV42 独特的 I - 基序结构，该结构对特定靶标具有高亲和力。
总结
在过去的 30 多年里，SELEX 技术和适配体分离技术发展迅速。适配体技术在病原体检测、药物递送、体内检测、抑制肿瘤转移、抑制病毒感染等众多领域前景广阔。尽管 SELEX 过程存在诸多挑战，但只要仔细考量每一个步骤，就能成功筛选适配体，必要时进行修饰，实现最终应用。
