编辑推荐：
在先天性无虹膜相关角膜病变（AAK）研究中，研究人员探究敲低 KRT3 对健康角膜缘上皮细胞（LECs）中 PAX6 及相关基因表达的影响。结果发现 KRT3 敲低改变基因表达，且炎症刺激下 LECs 反应不同。这为 AAK 等疾病研究提供新方向。
眼睛是心灵的窗户，而角膜作为眼睛的重要组成部分，其健康至关重要。在眼科领域，先天性无虹膜是一种因 PAX6 单倍体不足引发的罕见疾病，患者不仅会出现虹膜发育不全等症状，还常伴有进行性无虹膜相关角膜病变（AAK）。研究发现，PAX6 单倍体不足会导致原发性角膜缘上皮细胞（LECs）中角蛋白 3（KRT3）和角蛋白 12（KRT12）表达降低，这很可能是 AAK 发展和进展的关键因素。此外，先天性无虹膜患者的眼表处于炎症环境，这进一步加剧了病情的复杂性。
为了深入探究 KRT3 在这一疾病进程中的作用，来自德国的研究人员开展了相关研究。他们通过小干扰 RNA（siRNA）沉默技术，在健康的 LECs 中敲低 KRT3，观察其在正常和炎症条件下对 PAX6 及其他相关基因表达的影响。该研究成果发表在《Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger》上，为眼科疾病的研究提供了新的视角和理论依据。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是细胞转染技术，将 KRT3 siRNA 转染至人原发性 LECs，实现 KRT3 的敲低；然后利用定量聚合酶链反应（qPCR）、蛋白质免疫印迹（Western blotting）和酶联免疫吸附测定（ELISA）技术，分别从基因和蛋白质水平分析相关指标的表达变化。研究样本来自角膜移植术后的角膜巩膜缘，保证了实验的临床相关性。
研究结果
- KRT3 敲低对自身表达的影响：通过 qPCR 和 Western blotting 检测发现，KRT3 siRNA 转染后，无论是否存在脂多糖（LPS）诱导的炎症，KRT3 的 mRNA 和蛋白质表达均显著降低。在对照 siRNA 转染的细胞中，白细胞介素 1β（IL-1β）诱导的炎症会使 KRT3 的 mRNA 水平明显下降，且其蛋白质表达在 IL-1β 诱导的炎症中比在 LPS 诱导的炎症中更低。
- 对其他角蛋白表达的影响：KRT3 siRNA 敲低后，KRT12、KRT13 和 KRT19 的 mRNA 水平在有无 LPS 或 IL-1β 处理的情况下均无显著变化。这表明 KRT3 的敲低并未引起这些角蛋白表达的明显改变，暗示了它们在角膜缘上皮细胞中的表达调控可能相对独立于 KRT3。
- 对转录因子、视黄酸信号成分和基质金属蛋白酶 2（MMP2）表达的影响：KRT3 siRNA 敲低后，PAX6、FOSL2、FABP5、CRABP2 和 ALDH3A1 的 mRNA 水平未发生显著变化。而 DSG1 和 ADH7 的 mRNA 水平在非炎症条件下显著上调，但在 KRT3 敲低的 LECs 中，IL-1β 诱导的炎症会使其 mRNA 水平下调。PPARγ 的 mRNA 水平在 KRT3 敲低后显著上调，LPS 处理会进一步增加其表达，但这些变化在蛋白质水平均未体现。此外，MMP2 的 mRNA 表达在 KRT3 敲低后显著下调，不过其蛋白质水平在细胞培养上清液中无明显变化。
- 对炎症和促血管生成因子表达的影响：KRT3 敲低导致 IL-6 的 mRNA 和蛋白质水平降低，且不受 LPS 或 IL-1β 诱导的炎症影响。在对照 siRNA 转染的 LECs 中，LPS 或 IL-1β 刺激会使 IL-6 蛋白质水平上调。KRT3 敲低还使无炎症刺激时 MAPK1 的 mRNA 水平下降，且在 KRT3 敲低的 LECs 中，IL-1β 诱导的炎症下 ERK2 蛋白质水平低于 LPS 诱导的炎症。而 NF-κB、VEGFA 和 MAPK3 的 mRNA 水平在 KRT3 敲低后，无论是否有 LPS 或 IL-1β 处理均无显著变化。
研究结论与讨论
该研究表明，在正常 LECs 中，炎症刺激会通过反馈回路刺激 IL-6 产生，但在 KRT3 敲低的 LECs 中，这种调节机制缺失。即使存在炎症，KRT3 敲低的 LECs 仍保持相同水平的炎症 IL-6 蛋白质分泌。这一发现揭示了 KRT3 敲低的 LECs 对炎症条件的独特反应，表明它们无法像正常 LECs 那样参与典型的反馈调节。
在先天性无虹膜（PAX6 敲低）的 LECs 中，研究人员推测由于 KRT3 敲低，LECs 无法根据炎症刺激调整分化过程或调节 IL-6 分泌，这进一步证明了 KRT3 敲低在 AAK 发展和进展中的关键作用。在 Meesmann 上皮角膜营养不良中，KRT3 敲低也会导致 LECs 中 IL-6 蛋白质水平下调，且对外界炎症刺激缺乏 IL-6 分泌反应，这可能与该疾病中上皮变化和上皮 - 基质相互作用的破坏有关。
此外，研究还发现 KRT3 敲低会引起 DSG1、ADH7、PPARγ 转录水平的变化，以及 MAPK1 转录水平的下调，但这些变化在蛋白质水平并不总是一致，这可能暗示了视黄酸信号通路中存在潜在的反馈调节机制。虽然 PPARγ mRNA 水平在 KRT3 敲低的细胞中上调，但蛋白质水平未改变，表明下游靶点可能参与调节转录因子的活性。
从临床角度来看，异常的 KRT3 表达有望成为监测 AAK 进展的诊断工具，同时，靶向调节 KRT3 可能会影响细胞命运决定，改善基于干细胞的角膜疾病治疗效果。对于 KRT3 表达受损的患者，如携带 PAX6 致病突变的先天性无虹膜患者或 Meesmann 角膜营养不良患者，使用抗炎眼药水或 IL-6 通路调节剂可能有助于抑制炎症。
然而，该研究也存在一定的局限性。体外培养条件无法模拟体内复杂的基因网络、分子相互作用和信号通路，因此需要在动物模型中进一步研究 KRT3 敲低的长期影响。对于 DSG1、ADH7 和 PPARγ 在转录和蛋白质水平变化不一致的潜在机制，也需要通过长期体内研究来深入探索。
总体而言，这项研究为理解角膜缘上皮细胞在健康和疾病状态下的生物学机制提供了重要线索，为未来眼科疾病的诊断和治疗开辟了新的研究方向。
