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本文聚焦黄素蛋白醌还原酶，阐述醌在其中的结合模式。这些酶能催化底物氧化和醌还原，生成的醌醇具有代谢和抗氧化作用。文中以 6 种酶为例，分析结合模式差异，探讨其对电子转移机制及生理功能的影响，为相关研究提供重要参考。
引言
醌是一类在生命各领域广泛存在的氧化还原活性生物分子，依据核心结构可大致分为苯醌、萘醌和蒽醌。像泛醌（辅酶 Q）、质体醌、维生素 K 系列等，在呼吸电子传递、生物合成途径、抗氧化应激等诸多生理过程中发挥着关键作用。醌还原酶对于醌的抗氧化和代谢功能至关重要，其中黄素蛋白是常见的辅酶，能介导单电子和双电子化学反应。不过，通过对蛋白数据库中黄素蛋白醌氧化还原酶的研究发现，醌通常结合在黄素异咯嗪的周边，这种结合模式与传统的氢化物转移机制相悖，却能生成醌醇，背后的原因值得深入探究。本文挑选了 6 种典型的黄素蛋白醌氧化还原酶进行综述，旨在剖析醌的结合模式及其意义。
硫化物醌氧化还原酶（SQR 或 SQOR）
SQR 属于黄素二硫化物还原酶（FDR）类，能利用还原态硫化合物（如 H2S）的电子还原醌底物，实现硫化合物的解毒并产生可用于代谢的还原态醌。在不同生物中，SQR 的生理功能有所不同，比如在极端嗜热蓝藻中参与无氧光合作用，在高等真核生物线粒体中主要负责硫化氢解毒，还与半胱氨酸生物合成有关，其醌结合位点也成为治疗心力衰竭药物的靶点。
不同物种的 SQR 底物特异性存在差异，多数对苯醌底物有广泛特异性，部分对萘醌也有一定活性。关于其硫受体，原核生物的 SQR 以硫化氢为生理受体，而真核生物的 SQR，谷胱甘肽和亚硫酸盐都曾被认为是可能的生理受体，但目前尚无定论，综合考虑，谷胱甘肽更有可能。
已解析出 3 种与醌结合的 SQR 结构。嗜热毁丝霉（A. aeolicus）的 SQR 为同源三聚体，醌（Q10）大致平行于黄素结合，距离 C2 氧约 3.5?，苯醌部分位于略带正电的空腔，异戊二烯尾通向膜结合域；氧化亚铁硫杆菌（A. ferrooxidans）的 SQR 为二聚体（推测体内为单体），醌结合在黄素嘧啶端约 3? 处，堆叠在两个芳香侧链之间；人类 SQR 在体内也被认为是单体，醌通过羰基氧与 Trp345 和 Ser378 形成氢键，同样平行于黄素结合。
由于醌与黄素的结合偏移，SQR 对醌的还原无法通过氢化物转移实现，而需通过连续的单电子转移。虽然目前对醌还原步骤的研究较少，但计算表明在人类 SQR 中，电子从 FAD 的 O2 经空间转移到泛醌的甲氧基碳，每次还原伴随从 Trp345 或 Ser378 夺取一个质子。
二氢乳清酸脱氢酶（DHOD）
DHOD 催化从头嘧啶生物合成中唯一的氧化还原反应，将二氢乳清酸氧化为乳清酸并引入 5,6 - 乙烯基键。快速分裂的细胞（如 T 细胞、癌细胞和许多致病单细胞生物）依赖此途径获取足够的嘧啶碱基，因此 DHOD 成为治疗关节炎、细菌感染和癌症的药物靶点。
DHOD2 属于结合醌的 DHOD 类，含有单个 FMN 辅因子，对醌底物特异性广泛，能与多种醌反应，且异戊二烯尾越长，催化效率越高。其还原态醌产物进入电子传递链，与 ATP 生成偶联。
在还原半反应中，二氢乳清酸（DHO）平行于 FMN 并堆叠在其 si 面上方约 3.5?，利于氢化物从 DHO 的 C6 转移到 FMN 的 N5，同时一个丝氨酸残基从 DHO 夺取质子生成乳清酸。与 1 类 DHOD 的协同氧化和去质子化机制不同，DHOD2 采用分步机制。
DHOD2 是膜结合单体酶，由 C 端大结构域和 N 端小结构域组成。C 端结构域含 Rossmann 折叠，结合 FMN 和乳清酸，还有一个移动环；N 端结构域含两个 α- 螺旋，促进膜结合，其正电荷表面与膜脂质头基相互作用。醌结合位点推测在 N 端结构域的两个螺旋之间，形成一个通向 FMN 活性位点的通道。虽然该位点未通过晶体学观察到，但通过动力学实验和与醌类似物结合的晶体结构推测，醌与 FMN 大致垂直结合，距离二甲苯端约 4?，占据疏水口袋并形成氢键。
目前对 DHOD2 的氧化半反应机制了解较少，已知其比还原半反应快约 4 倍。由于醌结合位点的限制，醌还原需通过连续单电子转移，实验也证实其能参与单电子转移化学，且第二个电子转移比第一个快，整个过程受第一个电子转移限速。
脯氨酸脱氢酶（ProDH）
ProDH 催化脯氨酸分解代谢的第一步，将脯氨酸转化为 Δ1- 吡咯啉 - 5 - 羧酸（P5C），随后 P5C 水解为 L - 谷氨酸 - 5 - 半醛（GSAL），再被氧化为谷氨酸。在原核生物中，ProDH 可使细菌利用脯氨酸作为能源；在高等生物中，ProDH 具有多种功能，如解毒过量脯氨酸、产生活性氧、为 GABA 生物合成提供前体、调节线粒体呼吸等，因此成为治疗细菌感染、癌症和精神分裂症的药物靶点。
细菌的 ProDH 形式多样，包括三功能的 PutA、双功能的 PutA 和单功能的 ProDH。三功能的 PutA（如大肠杆菌的 PutA）能催化脯氨酸和 P5C 的氧化，还作为转录调节因子调控 put 操纵子；双功能的 PutA 保留两种催化活性但无转录调节功能；单功能的 ProDH 与单独的 P5CDH 协同作用。PutA 酶可能存在底物通道化现象，即 P5C 中间体不释放到溶液中，直接从 ProDH 活性位点转移到 P5CDH 活性位点。
已解析出双功能和单功能 ProDH 的晶体结构，以脱硫弧菌（G. sulfurreducens）的双功能 PutA 为例，其为同源二聚体，ProDH 结构域具有 (αβ)8- 桶状折叠。通过与萘醌亚硫酸氢盐（menaquinone bisulfite，MB）结合的晶体结构推测，醌结合在 FAD 的 si 面，与 N5 距离约 3?，与异咯嗪形成 40° 角，其羰基氧与多个氨基酸残基相互作用。不过，该结合位点存在一些疑问，如晶体结构中观察到的通道可能是人为造成的，且膜结合区域的定位也不确定。
虽然目前对 ProDH 中醌还原机制了解有限，但醌与异咯嗪的接近程度暗示可能通过氢化物转移还原，不过其结合角度又不利于氢化物转移，也可能是单电子转移，还需更多研究加以明确。
Na+转运 NADH: 醌氧化还原酶（Na-NQR 或 NQR）
一些致病细菌利用 Na-NQR 替代呼吸电子传递链中的复合物 I，可产生钠梯度用于呼吸，使其能在高盐环境（如血液）中生存，因此 NQR 成为治疗霍乱等疾病的药物靶点。
NQR 的还原半反应较为复杂，由 6 个亚基组成，包含 6 种辅因子（FAD、两个 FMN、核黄素、一个 Fe2S2簇和另一个含铁辅因子）。电子从 NADH 经一系列辅因子传递，过程涉及多个阶段和辅因子的氧化还原变化。
NQR 的 6 个亚基中有 5 个含有跨膜螺旋，NqrA 为胞质亚基。其醌结合位点的确定存在争议，早期研究认为在 NqrA 亚基，但后续研究发现 NqrB 亚基也可能存在结合位点。目前晶体和冷冻电镜结构显示，醌结合在 NqrB 亚基的位点，但该位点与核黄素距离较远，从结构上看不太可能是催化位点；而 NqrA 亚基的结合位点虽有证据支持，但也存在疑问，因此催化醌结合位点尚未确定。
由于醌结合位点不明确，对醌还原机制的研究也受到限制。已知电子通过核黄素传递，核黄素常以单电子还原态存在，推测 NQR 可能通过单电子转移还原醌，也有观点认为可能生成泛半醌而非泛醌醇。
胞质醌还原酶（NQO1 和 NQO2）
NQO1 和 NQO2 介导胞质醌还原酶活性。NQO1 可利用 NAD (P) H 将醌和醌样分子进行双电子还原，避免有害的氧化还原循环，主要功能是解毒膳食醌，还参与维生素 K 循环，是抗凝药物的靶点，也可用于激活醌样前药。NQO2 被认为是 NQO1 的同工型，序列相似性约 50%，但它不能氧化 NAD (P) H，而是使用二氢烟酰胺的单核苷衍生物作为底物，其生理作用尚不完全明确，可能参与 1,2 - 醌的解毒，与神经系统疾病有关。此外，NQO1 和 NQO2 还可能具有非酶促作用，如 NQO1 保护肿瘤抑制蛋白，NQO2 可能是褪黑素受体或体内平衡调节剂。
NQO1 和 NQO2 结构相似，均为同源二聚体，每个亚基含一个靠近二聚体界面的溶剂可及 FAD，由大催化结构域和小 C 端结构域组成。二者活性位点相似但有差异，这些差异影响底物特异性。两种同工型均已与醌形成晶体结构，醌堆叠在 FAD 的 si 面，在活性位点占据空间较小，与蛋白接触有限。
关于 NQO 中醌还原机制，可能是氢化物转移或连续单电子转移。结构数据支持氢化物转移机制，但也有实验表明 NQO1 可稳定单电子还原态，NQO2 不与单电子受体发生氧化反应，目前证据倾向于 NQO1 采用氢化物转移机制，但不能完全排除单电子转移机制。
替代 NADH: 醌氧化还原酶（NDH-2）
NDH-2 家族通常作为电子传递链的次要入口，在不同生物中广泛存在，能生成醌醇参与电子传递，部分同源物还具有替代功能。以动物中的铁死亡抑制蛋白 1（FSP1）为例，它最初被认为是促凋亡蛋白，后发现具有抗铁死亡作用，通过生成醌醇拦截自由基，防止脂质过氧化，还能还原维生素 K，影响凝血级联反应，是癌症和凝血障碍的药物靶点。
已对人 HsFSP1 和鸡 GgFSP1 进行结构表征，二者序列同源性 70%，结构相似。HsFSP1 在溶液中为单体，GgFSP1 为二聚体。FSP1 由三个结构域组成，FAD 位于三个亚基界面，其 re 面朝向 NAD (P) 结合结构域，有通道通向膜，利于醌从膜上解吸。
GgFSP1 的醌结合位点已通过晶体学确定，苯醌头基与异咯嗪嘧啶端大致垂直，距离约 2.5?，通过氢键与 N3 结合。HsFSP1 虽未与醌形成晶体结构，但根据与 GgFSP1 的结构相似性可预测其醌结合位点。由于 HsFSP1 的周转受 NADP+释放限速，醌还原速率极快，目前对其醌还原机制的动力学细节尚不清楚，但结合模式表明是通过两个单电子转移进行。
讨论
在讨论的 6 种酶中，4 种酶中醌的结合取向需要连续的单电子转移步骤，2 种酶中醌的结合取向有利于氢化物转移。这表明黄素蛋白醌还原酶可采用这两种机制，进化选择其中一种可能具有重要意义。一种解释是单电子转移途径的能量学为逆向反应创造了动力学障碍，将电子捕获在醌池中，对抗膜中高比例的醌醇与醌；另一种解释是醌的端对端结合模式使酶能够为胞质和膜相关底物利用不同的结合位点，避免底物解吸，这两种效应可能相互叠加，使电子尽可能高效地进入醌池。
结论
黄素蛋白氧化还原酶中醌的特殊结合模式与这些酶的生理功能密切相关。膜结合醌还原酶中观察到的端对端结合模式排除了简单的氢化物转移还原机制，但维持了胞质和膜嵌入底物之间的分隔。底物半醌中间体相对较高的氧化还原电位，以及结合模式对电子转移方向和效率的影响，共同塑造了这些酶在细胞代谢和抗氧化防御中的独特作用，为深入理解相关生理过程和开发靶向药物提供了理论基础。
