微环境响应型活体水凝胶搭载工程化益生菌促进大段骨缺损修复的研究

为解决大段骨缺损修复中微环境动态变化与生长因子精准释放的难题，研究人员开发了一种基于工程化大肠杆菌Nissle 1917（EcN）的活体响应再生医学（LRRM）策略。通过构建NO诱导型基因回路，使益生菌实时感知内源性一氧化氮（NO）信号并分泌骨形态发生蛋白-2（BMP2），再通过双层结构的明胶甲基丙烯酰（GelMA）/透明质酸甲基丙烯酰（HAMA）水凝胶封装系统实现可控释放。动物实验证实该体系显著促进骨痂成熟、新生血管形成和全层骨愈合，为智能骨再生材料设计提供了新范式。

　　

骨缺损修复的困境与突破
骨骼作为人体的支撑结构，其损伤修复一直是临床难题。大段骨缺损常由严重创伤或肿瘤切除导致，传统治疗方法如自体骨移植存在供区并发症风险，而合成骨替代材料往往缺乏动态响应能力。尽管骨形态发生蛋白-2（BMP2）已被证实具有强效成骨作用，但现有递送系统存在爆发性释放、半衰期短等问题，可能导致异位骨化、血管化失败甚至致癌风险。更关键的是，骨折愈合过程涉及复杂的微环境变化——研究显示损伤后7-14天内源性一氧化氮（NO）水平会显著升高，但现有材料无法利用这一生物信号实现精准治疗。

智能活体材料的创新设计
上海交通大学医学院附属第六人民医院联合研究团队在《Bioactive Materials》发表的研究中，开创性地将合成生物学与组织工程技术结合，构建了微环境响应型活体水凝胶系统。该研究以临床安全的大肠杆菌Nissle 1917（EcN）为底盘，通过基因工程改造使其携带NO感应-响应系统：当感知到骨折部位升高的NO信号时，PnorVβ启动子驱动NorR调控蛋白表达，进而激活下游BMP2的合成与分泌。为保障生物安全性，研究人员采用双层封装策略——先将工程菌包裹在100μm级GelMA微球中，再嵌入大块HAMA水凝胶网络，形成物理隔离屏障。

关键技术方法
研究主要运用了：（1）合成生物学技术构建NO诱导型基因回路；（2）微流控技术制备细菌负载的GelMA微球；（3）光交联法制备复合水凝胶；（4）小鼠股骨骨折和颅骨缺损模型评估疗效；（5）Micro-CT和组织学分析骨再生效果。所有动物实验均通过上海交通大学医学院动物伦理委员会审批。

NO感应系统的精准调控
通过改造的pET22b-PnorVβ-norR-gfp质粒验证显示，工程菌在1000μM NO供体（DETA-NONOate）刺激下，12小时即可达到GFP表达峰值（图2）。Western blot和ELISA证实，转入bmp2基因的EcN_BMP2菌株能分泌具有生物活性的BMP2蛋白（11.15±0.02 ng/mL）。这种感应系统具有高度特异性，对生理浓度范围内的NO（nM-μM级）呈现剂量依赖性响应。

双层水凝胶的协同保护
扫描电镜显示GelMA微球与HAMA基质形成多孔互穿网络结构（图3）。活死染色证实封装细菌可存活7天以上，而细菌泄漏实验表明双层结构能完全阻隔微生物逃逸（泄漏率0% vs 单层HAMA的6.3%）。体外实验显示，在NO刺激下，水凝胶可持续释放BMP2达72小时，且不影响人间充质干细胞（BMSCs）的增殖和形态。

动物模型的治疗验证
在股骨骨折模型中，mEcN@H组（含EcN_BMP2水凝胶）治疗28天即实现骨折线消失，Micro-CT显示其骨矿物质密度（BMD）达0.39±0.02 g/cm³，显著高于对照组（图6）。组织学分析揭示该组软骨痂比例（14.26±1.75%）仅为对照组的1/3，而I型胶原（COL1）沉积和CD31⁺血管密度分别提高2倍和3倍。颅骨缺损模型同样显示，mEcN@H组新生骨体积占比（BV/TV 53.18±3.83%）和RUNX2表达水平显著提升。

临床转化的深远意义
该研究首次实现了三大突破：（1）利用内源性NO信号作为生物触发器，建立骨折修复的自主反馈系统；（2）通过基因回路编程使益生菌成为"智能药物工厂"；（3）双层水凝胶设计兼顾细菌存活与生物 containment。相比传统BMP2缓释系统，这种活体响应再生医学（LRRM）策略可根据损伤微环境动态调整给药剂量，避免过量释放风险。研究者指出，该平台技术可拓展至其他疾病标记物感应系统，未来通过改造多基因回路，有望实现VEGF等因子的协同递送，为复杂组织再生提供新思路。

挑战与展望
尽管成果显著，该技术仍需解决长效存活、机械强度优化等难题。值得注意的是，所有实验动物均未出现感染或全身炎症反应，血液学指标保持正常，证实了该系统的安全性。随着合成生物学与材料学的深度融合，这种"感知-响应"型活体治疗策略或将成为下一代再生医学的核心技术。