综述：真核生物 RNA 引导的程序性 DNA 消除的功能与机制

这篇综述聚焦真核生物程序性 DNA 消除（PDE）。详细阐述其在不同生物中的功能，如性别决定、基因沉默和基因组防御；剖析细胞识别及切割 DNA 的机制；探讨相关分子机器；还展望其用于基因组编辑的潜力，为该领域研究提供全面参考。

　　

程序性 DNA 消除

准确维持遗传信息对细胞正常功能至关重要，染色体错误，如胚胎发育过程中的 DNA 消除等，会导致妊娠丢失或后代遗传疾病。然而，有一种特殊的消除形式 —— 程序性 DNA 消除（PDE），它能精准去除特定基因组区域，在真核生物减数分裂后的生殖过程中普遍存在，涉及多种生物，从单细胞的纤毛虫到哺乳动物都有。这一过程在进化中多次独立出现，具有重要的生物学意义，如不可逆地沉默不必要基因、保护基因组免受入侵序列影响、参与性别决定等。

PDE 的功能

1. 性别决定和物种兼容性：在一些生物中，PDE 在性别决定和物种兼容性方面发挥关键作用。例如书虱（Liposcelis）在胚胎发生过程中，通过父本染色体上异染色质形成并随后消除来决定性别；线虫（Strongyloides）属的一些物种也借助 PDE 进行性别决定。在植物中，DNA 消除能实现物种分离和杂种兼容性的判定，像一些植物会基于父本染色体的丢失或保留来决定是否杂交成功。在昆虫、鱼类、蛙类以及哺乳动物等生物中，也存在因 PDE 导致的父本基因组消除现象，如某些雌性袋狸会消除父本 X 染色体，以此进行 X 染色体剂量补偿 。
2. 基因组精简：PDE 在基因组精简方面作用显著。在无颌脊椎动物如七鳃鳗（Petromyzon）和盲鳗（Myxine）中，PDE 会靶向重复元件和发育特异性基因，在胚胎发育过程中不可逆地调控转录程序，使体细胞基因组内容更精简。许多鸣禽通过减数分裂时的差异染色体分离，区分生殖细胞和体细胞，其生殖系限制性染色体上的特定基因对卵母细胞成熟至关重要。寄生蠕虫蛔虫（Ascaris）利用 PDE 永久性沉默体细胞中对配子发生和胚胎发生至关重要的基因。此外，在山羊草（Aegilops speltoides）的根中，会选择性消除 B 染色体，形成体细胞嵌合体，实现基因组精简。而在具有核二态性的单细胞生物（如纤毛虫）中，精简体细胞基因组能降低 DNA 复制的能量消耗。
3. 基因组防御：PDE 还能抵御入侵序列，保护基因组。在纤毛虫的有性生殖和桡足类的卵子发生过程中，转座子等入侵序列较为活跃，而 PDE 能有效消除这些序列。例如，一些纤毛虫物种可去除高达 97% 的生殖系基因组中的入侵序列，桡足类在胚胎发生过程中能高效消除超过 80% 由重复元件组成的生殖系基因组，且更倾向于消除进化上较新且高度活跃的转座子序列，这表明 PDE 是一种重要的基因组保护机制。

区分消除和保留 DNA 的细胞机制

1. 基于着丝粒的机制：不同物种区分消除和保留 DNA 的机制各异。在植物杂种中，着丝粒蛋白对亲本着丝粒重复序列的亲和力差异，可导致无着丝粒的染色体在后续有丝分裂中被消除。蛔虫属的寄生虫会消除多中心染色体上缺乏着丝粒重复序列的大片段区域，这些区域两侧有保守的切割位点，切割后会被排除到微核中。而在生殖系中，可能需要转录一种特殊的着丝粒 RNA，来介导形成暂时的生殖系特异性着丝粒，以保留这些区域。
2. sRNA 介导的机制：对于精确消除短序列，纤毛虫采用了更为复杂的机制。其消除的序列通常短于 100bp 且缺乏长的保守序列基序，主要依靠 sRNA 介导的特异性识别。在不同的纤毛虫物种中，sRNA 的作用方式不同。在草履虫（Paramecium）和四膜虫（Tetrahymena）中，sRNA 与要消除的区域互补；而在游仆虫（Oxytricha）和尖毛虫（Stylonychia）中，sRNA 标记需要保留的序列。sRNA - PIWI 复合物在纤毛虫中的作用类似于 piRNA，它能识别特定的非编码转录本，且减数分裂重组对后续的 DNA 消除步骤至关重要，至少有两个减数分裂特异性因子参与调控初始引导 sRNA 的产生。
3. 异染色质化和 DNA 甲基化：与其他真核生物中转座子沉默类似，纤毛虫的 sRNA - 蛋白复合物结合互补转录本后，会招募效应蛋白，导致异染色质化。例如，加载 sRNA 的 PIWI 蛋白可招募 PRC2 样复合物，在要消除的 DNA 位点建立 H3K9me³和 H3K27me³修饰。在一些昆虫中，父本基因组消除也与异染色质化有关，消除的遗传物质在减数分裂前会积累异染色质相关蛋白。此外，在七鳃鳗中，被消除序列会发生胞嘧啶超甲基化；在植物中，sRNA 介导的 DNA 甲基化可抑制转座子。在纤毛虫中，也发现了与 DNA 消除相关的甲基化现象，如在四膜虫中发现了高度活跃的真核 DNA 腺嘌呤甲基化复合物，在草履虫和游仆虫中，DNA 6 - 腺嘌呤甲基化（6mA）会影响核小体定位，干扰甲基化复合物会导致执行 PDE 的后代出现严重致死现象，这表明 DNA 甲基化可能在纤毛虫的 PDE 过程中发挥重要作用，但具体机制仍有待进一步研究。

参与程序性 DNA 切割的分子机器

1. 不同生物的切割机制差异：由于 PDE 过程可能多次独立进化，不同生物在 DNA 切割步骤中涉及的酶和原理各不相同。在蠕虫（Oscheius tipulae）中，被消除的 DNA 两侧有保守序列基序，可招募切割复合物到正确位点。在纤毛虫中，除了 sRNA 引导的切割外，还存在 sRNA 非依赖的切割方式，用于消除着丝粒区域和进行染色体断裂，染色体断裂后会进行从头端粒化；而 sRNA 引导的 PDE 通常会在切割后直接连接自由 DNA 末端，以重建被消除 DNA 打断的蛋白质编码序列（CDS） 。例如，在游仆虫中，CDS 重建需要将 DNA 片段与长 RNA 进行比较，以确保片段正确连接。
2. 切割过程中的关键因子：在草履虫中，DNA 去除过程似乎是顺序进行的，涉及两类不同的 sRNAs，初始的 scanRNAs 转录自生殖系，随后的 iesRNAs 直接由被消除的 DNA 产生，形成正反馈循环促进切割。PDE 过程是一个精确执行的多步骤过程，在草履虫中，PDE 相关基因的表达会根据 PDE 进程进行微调，细胞核之间存在双向的相互作用，这可能确保了 PDE 过程中的检查点以及生殖系到体细胞核表型的转变。在一些纤毛虫物种（如草履虫和四膜虫）中，一种驯化的 PiggyBac 样转座酶执行 DNA 切割步骤，但该酶的选择性核酸酶活性尚未在纯化蛋白中直接证实，可能需要其他因素（如支架蛋白、DNA 修复和连接相关蛋白）的参与才能激活其核酸酶活性。
3. 其他相关酶和修饰：RNA 解旋酶在四膜虫中对 sRNA 与靶转录本的碱基配对至关重要，组蛋白伴侣 spt16 - 1 有助于 PiggyBac 正确定位到发育中的细胞核。此外，SUMOylation 这种翻译后修饰在纤毛虫的 PDE 过程中广泛存在且上调，它可能通过 PIWI 依赖的方式参与 sRNA 介导的转座子沉默和异染色质化过程。最后，特定的 DNA 组织形式可能对 DNA 消除和自由 DNA 末端的正确连接至关重要，在草履虫中发现了减数分裂特异性的 SMC 蛋白和凝缩蛋白复合物参与 DNA 消除过程，但它们具体是促进发育特异性基因表达，还是参与形成切割机器识别的 DNA 环，仍有待进一步研究。

展望：DNA 消除机制在基因组编辑中的潜力

1. 纤毛虫的独特机制与进化意义：在大多数真核生物中，piRNA 样 sRNAs 参与抵御入侵的转座子。而纤毛虫将这种抑制反应发挥到极致，通过核二态性和扫描过程，永久性地从体细胞基因组中消除转座子衍生序列。这一过程涉及两轮 sRNAs，第二轮 sRNAs 由新切除的 DNA 片段产生，形成正反馈循环。由于这些 DNA 片段大多小于 100bp，需要先连接成环再转录，这种独特的机制体现了纤毛虫对分子机制的独特利用和进化。
2. 基因组编辑的应用前景与挑战：纤毛虫的 PiggyBac 转座子抑制系统是转座子驯化的重要成果，在进化中具有重要意义。真核生物中的转座酶，如 PiggyBac 家族的转座酶，是人类细胞中基因组整合长转基因的高效工具，但临床应用中存在插入位点不可控的安全问题。RNA 引导的转座酶为解决这一问题提供了可能，如细菌来源的 I 型和 V - K 型 CRISPR 相关转座酶（CAST），但它们也存在效率或特异性方面的问题。通过蛋白质工程等手段，有望优化这些工具。此外，借鉴纤毛虫中 sRNA/PIWIs 通过结合新生转录本间接招募到目标 DNA 位置的方式，可能为解决 DNA 拓扑结构对结合特异性的影响提供思路，但 sRNA 引导的 DNA 消除机制能否满足在人类等真核生物中进行精确基因组编辑的所有要求，仍需进一步研究。深入理解不同生物中的 PDE 过程，有望为基因组编辑工具的开发提供更多资源。

展望

1. 研究领域的重要性：程序性 DNA 消除（PDE）在真核生物中广泛存在，是趋同进化的结果。它解决了生物如何处理不必要 DNA 的问题，在纤毛虫中，PDE 在过程性和精确性方面表现出色，能以碱基对精度消除数千个片段。
2. 当前的认识：纤毛虫中 DNA 消除的精确性使其成为一种抵御入侵 DNA 序列（如转座子）的免疫系统。这一过程在有性生殖期间，通过基于 RNA 的方式比较生殖系和体细胞核的基因内容。首先，生殖系产生 sRNAs，那些在旧版本体细胞核中找不到匹配的 sRNAs，在新的体细胞核从生殖系序列形成时转移到新核中。sRNAs 仅与生殖系中出现但旧体细胞核中不存在的序列互补，随后通过复杂的机制引导匹配 DNA 序列的消除。
3. 未来研究方向：PDE 在抑制入侵序列方面的功能，有助于揭示真核生物染色质早期进化阶段的信息。近年来发展的先进蛋白质组学技术，将有助于深入研究纤毛虫中 sRNA 指导的 DNA 消除过程的机制。明确 sRNA 特异性识别 DNA 与后续 DNA 消除步骤之间的联系，可能会发现新的体内 DNA 操作分子工具，为基因编辑工具箱的扩展提供支持。开发更安全、更高效的 DNA 编辑系统，对于推动相关方法用于治疗目的和临床应用至关重要。